慢性淋巴细胞白血病患者血清TGF-β、IL-17、IL-4及IFN-γ水平变化及其临床意义

张　瑞， 庞楠楠， 李金花， 张正昊， 陈　刚， 曲建华

(1新疆医科大学第一附属医院血液病中心， 2新疆维吾尔自治区血液病研究所， 乌鲁木齐　830054)



慢性淋巴细胞白血病患者血清TGF-β、IL-17、IL-4及IFN-γ水平变化及其临床意义

张瑞1,2， 庞楠楠1,2， 李金花1,2， 张正昊1,2， 陈刚1,2， 曲建华1,2

(1新疆医科大学第一附属医院血液病中心，2新疆维吾尔自治区血液病研究所， 乌鲁木齐830054)

摘要：目的探讨慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者血清转化生长因子-β(TGF-β)、白介素-17(IL-17)、白介素-4(IL-4)及干扰素-γ(IFN-γ)水平变化及其临床意义。方法选取确诊为CLL患者60例为初诊CLL组，20例健康人作为对照组，并对32例患者进行了治疗随访(治疗后组)，用ELISA技术检测血清IL-17、TGF-β、IL-4和IFN-γ及其比值的变化。结果初诊CLL组患者外周血IL-17、TGF-β、IL-4、TGF-β/IL-17比值均高于对照组(P<0.05)，IFN-γ及IFN-γ/IL-4比值均低于对照组(P<0.05)，治疗后组TGF-β、IL-17、IL-4及TGF-β/IL-17均低于初诊CLL组(P<0.05)，IFN-γ及IFN-γ/IL-4高于初诊CLL组(P<0.05)。在Binet A期、B期、C期分期中，TGF-β/IL-17比值逐渐增高，其中C期高于A期和B期(P<0.05)，IFN-γ/ IL-4比值逐渐减低(P<0.05)，初诊CLL组患者TGF-β/IL-17及IFN-γ/ IL-4比值与Binet分期均呈正相关。 结论随着疾病的进展，CLL患者细胞因子IFN-γ/ IL-4和TGF-β/IL-17的格局发生变化，TGF-β/IL-17比值逐渐增高，IFN-γ/ IL-4比值逐渐减低，IFN-γ/ IL-4和TGF-β/IL-17的比值可能可以作为CLL患者疾病进展及预后评价指标之一。

关键词：慢性淋巴细胞白血病； 血清转化生长因子-β/白介素-17； 干扰素-γ/白介素-4； 预后

慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)是以成熟B淋巴细胞增殖为特点，受损细胞凋亡及肿瘤细胞生存期延长是本病发病机制中的重要因素[1-2]。目前认为CLL的发病机制与免疫异常有关，免疫功能紊乱既是导致其发生、发展的重要动因，又是其产生严重后果的根源[3-4]。辅助性T细胞(Th cell)作为获得性免疫的一部分，在抗肿瘤免疫中发挥重要作用。初始的CD4+T细胞在受到抗原刺激后，分化成不同的效应细胞，根据效应CD4+T细胞产生的细胞因子不同可分为辅助性T细胞1型(Th1)、辅助性T细胞2型(Th2)、辅助性T细胞17型(Th17)、调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)等[5]。Th1分泌的细胞因子干扰素-γ(IFN-γ)介导肿瘤细胞清除，Th2分泌的白介素-4(IL-4)、白介素-5(IL-5)参与体液免疫。目前有研究认为，Th1/Th2的分化失衡与CLL的发病机制密切相关[6]。Iwonas等[7]研究显示Th17及其所分泌的特异性细胞因子IL-17在CLL免疫中发挥保护作用。由调节性T细胞(Treg)细胞分泌的转化生长因子-β(TGF-β)是一种多功能的细胞因子，以细胞或背景依赖的方式发挥着肿瘤抑制或肿瘤促进的作用。Treg/Th17的失衡导致CLL的发生、发展，并影响预后[8]。本课题组研究已从Th1、Th2、Th17、Treg的特异转录因子层面证实，随着CLL疾病的进展，Th1/Th2和Th17/Treg失衡，并可能分别向Th2和Treg偏移[9]。

目前有关CLL疾病不同分期TGF-β、IL-17、IFN-γ、IL-4水平变化的研究较少，经过治疗后TGF-β、IL-17、IFN-γ、IL-4的变化关系未见报道。本研究运用酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)实验技术，检测不同分期CLL患者血清Th1、Th2、Th17和Treg细胞的相关细胞因子TGF-β、IL-17、IFN-γ及IL-4的水平，从细胞因子水平上探讨TGF-β、IL-17、IFN-γ、IL-4细胞因子及其比值在CLL不同分期中的变化特点；动态监测CLL患者临床药物治疗前、后各细胞因子及其比值平衡的变化，并分析临床意义。

1资料与方法

1.1一般资料选择2013年1月-2014年12月新疆医科大学第一附属医院血液中心及门诊收治的60例初治CLL患者(初诊CLL组)，其中男性37例(61.67%)，女性23例(38.33%)例，平均年龄(66.3±9.11)岁。记录CLL患者初诊时的临床资料，根据Binet分期分为5期：A期16例，B期25例，C期19例。随访治疗32例(治疗后组)，失访2例，死亡2例，未治疗28例。对照组20例，其中男性15例，女性5例，平均年龄为(63.2±13.2)岁，无相关自身免疫性疾病、肿瘤或近期感染史。两组受试者年龄及性别差异均无统计学意义(表1)。本研究通过新疆医科大学第一附属医院伦理委员会批准同意，且所有参与者均签署采血知情同意书和受者知情同意书。全部患者的临床表现、血象及骨髓象均符合《血液病诊断及疗效标准》[10]。

表1　CLL患者临床基本情况

注: “-”示无数据。

1.2指标检测应用ELISA法测定血清IL-17、TGF-β、IFN-γ及IL-4水平。采取健康体检者、CLL患者外周血，分离血清，-80℃保存备用。ELISA试剂盒均购自eBioScience公司，实验步骤严格按照说明书操作进行，实验中设置阳性对照和阴性对照孔。

2结果

2.1各组血清中细胞因子水平及比值变化

2.1.1各组血清中TGF-β、IL-17及其比值的变化初诊CLL组患者TGF-β、IL-17及 TGF-β/IL-17均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后组CLL患者血清中TGF-β、IL-17及TGF-β/IL-17低于初诊CLL组，差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后组CLL患者血清中TGF-β高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，治疗后组血清IL-17及TGF-β/IL-17高于对照组，但差异均无统计学意义(P>0.05)，见表2。

组别TGF-β/(pg/mL)IL-17/(pg/mL)TGF-β/IL-17对照组135.1±78.83*12.70±5.12*10.87±6.15*初诊CLL组268.98±62.5818.53±4.3618.26±8.76治疗后组184.52±67.6*Δ13.59±4.29*14.36±6.53*

注：与初诊CLL组比较，*P<0.05；与对照组比较，ΔP<0.05。

2.1.2各组血清中IFN-γ、IL-4及其比值的变化初诊CLL组患者IFN-γ水平及IFN-γ/IL-4比值较对照组低(P<0.05)，IL-4水平较对照组高，差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后组IFN-γ水平及IFN-γ/IL-4比值较初诊CLL组高，差异有统计学意义(P<0.05)；而治疗后组IL-4水平较初诊CLL组减低，差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后组血清中IFN-γ水平较对照组低，差异有统计学意义(P<0.05)；治疗后组IL-4水平较对照组高，差异无统计学意义(P>0.05)；治疗后组IFN-γ/ IL-4比值较对照组低，差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

组别IFN-γ/(pg/mL)IL-4/(pg/mL)IFN-γ/IL-4对照组32.59±4.53*2.57±0.74*14.20±6.30*初诊CLL组21.13±4.463.05±0.828.06±4.69治疗后组24.26±4.17*Δ2.65±0.87*11.05±7.04*

注：与初诊CLL组相比较，*P<0.05；与对照组相比较，ΔP<0.05。

2.2不同分期血清中细胞因子水平及比值变化随着疾病的进展，在Binet分期中，A期、B期、C期每两期间的TGF-β水平差异均无统计学意义(P>0.05)；IL-17水平逐渐减低，其中C期低于A期和B期(P<0.05)，A期与B期的IL-17水平差异无统计学意义(P>0.05)；分期越晚，TGF-β/IL-17比值逐渐增高，C期高于A期和B期(P<0.05)，A期与B期的TGF-β/IL-17比值差别无统计学意义(P>0.05)，Pearson相关分析显示二者呈正相关，差异有统计学意义(r=0.775，P=0.003)。C期IFN-γ水平低于B期(P<0.05)，但A期与B期差异无统计学意义(P>0.05)，C期IL-4水平高于B期，B期IL-4水平高于A期，差异均有统计学意义(P<0.05)；分期越晚，IFN-γ/IL-4比值逐渐减低，Binet A期、B期、C期每两期间的IFN-γ/IL-4比值差异均有统计学意义(P<0.05)，Pearson相关分析显示二者呈正相关，差异有统计学意义(r=0.624，P=0.003)，见表4。

BinetA期BinetB期BinetC期TGF-β/(pg/mL)223.45±64.52256.32±75.68282.08±81.10IL-17/(pg/mL)21.04±2.9619.57±3.9617.92±4.40IFN-γ/(pg/mL)23.74±6.1621.03±4.3219.65±4.72IL-4/(pg/mL)2.45±1.142.95±0.993.32±0.74TGF-β/IL-1712.52±6.4317.65±8.3621.29±10.73IFN-γ/IL-410.21±2.849.13±3.017.72±2.39

3讨论

慢性淋巴细胞白血病是一种临床发生、发展及预后高度可变的疾病。分泌IFN-γ的Th1细胞有抗肿瘤作用，可抑制来源于骨髓增殖性疾病患者的造血细胞，因此目前已应用IFN-γ治疗多种血液系统疾病如骨髓增殖性疾病。Th2在适应性免疫应答及固有免疫中起到重要连接，并可介导B淋巴细胞及T淋巴细胞应答。CLL的发生、发展与免疫机制有关，免疫相关性疾病发生大多是由免疫失衡引起，而免疫平衡系统由构成免疫系统的组织、细胞、分子共同维系，当内外环境发生变化，平衡也随之改变，处于动态平衡中。目前已在多种疾病中发现平衡的失调，如Th1/Th2细胞平衡失调与关节炎、非霍奇金淋巴瘤发病有关[11-12]。本研究发现CLL患者外周血中IL-4均较对照组增高，随着CLL疾病Binet分期进展IL-4水平增高，与Hill等[13]研究结果相符，IL-4可为疾病的预后提供有用的信息。临床分期是目前众所周知的CLL预后相关因素，分期越倾向中晚期，患者预后越差、生存期越短。本研究发现初诊CLL组IFN-γ水平低于对照组，分期越晚，IFN-γ水平越低，IFN-γ/IL-4比值较对照组低，并且C期低于B期，分期越晚，机体的免疫功能失衡越严重，Th1细胞的免疫功能受到抑制，Th2细胞高表达，IFN-γ的分泌减少，抗肿瘤细胞的作用减低，与文献[7]及文献[14]研究结果一致，提示随着疾病进展，平衡向Th2偏移，肿瘤细胞逃避免疫细胞监视，发生免疫逃避，不利于肿瘤清除，是预后不良的因素之一。

在正常机体内，Treg细胞维持自身免疫耐受和防止自身免疫反应的发生。最近有研究提示，在CLL患者中Treg细胞明显增多，并影响预后[15-16]，与本课题组前期研究结果一致[17]，表明 Treg细胞可作为评估CLL患者的疾病进展、疗效及预后指标。Th17细胞及其分泌的细胞因子IL-17对免疫细胞产生多效性作用，并且是炎症过程中的重要介质[18]。本研究发现CLL患者血清中的 IL-17水平较对照组增高，C期IL-17水平明显低于A期及B期，随着疾病进展IL-17减低，但其中抗肿瘤效应减弱而白血病细胞克隆占优势的机制目前尚不清楚；CLL患者TGF-β较对照组增高，并且增高幅度明显高于IL-17，C期TGF-β较A期及B期增加，但差异无统计学意义。国外已有研究证实，CLL疾病进展与Th17表达下调及Treg细胞分化导致白血病细胞增殖有关[19-21]。本研究同样发现初诊CLL组患者TGF-β/IL-17比值较对照组明显增高，随着分期进展，病情越重，TGF-β/IL-17比值越高，可能是过多的TGF-β抑制Th17的分化而促进Treg的分化发育，最终引起Treg/Th17向Treg细胞偏移，导致CLL疾病进展并影响患者预后。

本研究进一步动态监测CLL患者经过治疗后IL-17、TGF-β、IL-4、IFN-γ细胞因子及其比值的变化，结果显示治疗后组患者的TGF-β、IL-17及IL-4较初诊CLL组减低，而IFN-γ则相反，治疗后组患者TGF-β/IL-17低于初诊CLL组，IFN-γ/IL-4高于初诊CLL组。说明通过药物治疗会有效阻止静止时期的细胞DNA修复和分裂期的DNA合成，还能够促进Th2、Treg细胞快速消亡[22-23]。本研究结果进一步说明药物治疗可能有助于机体扭转IFN-γ/IL-4、TGF-β/IL-17失衡，同时影响肿瘤生长环境，有利于机体对肿瘤细胞的清除。

综上所述，CLL患者治疗前、后细胞因子TGF-β/IL-17和IFN-γ/ IL-4格局发生变化。因此如果动态检监测CLL患者血清中TGF-β/IL-17和IFN-γ/IL-4的变化情况，可了解患者免疫状态的变化，并进一步指导临床治疗。

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(本文编辑周芳)

The level and its clinical significance of TGF-β, IL-17, IL-4 and IFN-γ in serum of patients with chronic lymphocytic leukemia

ZHANG Rui1,2， PANG Nannan1,2， LI Jinhua1,2， ZHANG Zhenghao1,2， CHEN Gang1,2， QU Jianhua1,2

(1CenterofHematopathy，theFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity，

2InstituteHematologyofXinjiangUygurAutonomousRegion，Urumqi830054，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the clinical significance of TGF-β, IL-17, IL-4 and IFN-γ level in serum of patients with chronic lymphocytic leukemia (CLL) . MethodsThe study enrolled 20 healthy individuals and 60 CLL patients. 32 patients were received treatment and followed-up. ELISA was used to measure the level of transformation growth factor-β(TGF-β), interleukin-17(IL-17), interleukin-4 (TGF-β, IL-4), interferon-γ(IFN-γ) in the serum of the every group. Results(1)The level of IL-17, TGF-β, IL-4 and the ratio of TGF-β/IL-17 in peripheral blood of first visit CLL patients group were higher than those in the control group (P<0.05). The level of IFN-γ and the ratio of IFN-γ/IL-4 were lower than those in the control group (P<0.05). Compared with the CLL group, the treated cases had the lower level of TGF-β, IL-17, IL-4 and TGF-β/IL-17 (P<0.05). The ratio of IFN-γ and IFN-γ/IL-4 in treated cases was higher (P<0.05) than that in the CLL group. (2) In stage of Binet A, B, C, the later stage the higher ratio of TGF-β/IL-17 and the ratio of TGF-β/IL-17 in stage Binet C was higher than that in stage Binet A and Binet B (P<0.05). In the later the stage，the the ratio of IFN-γ/ IL-4 decreased gradually (P<0.05). The ratio of IFN-γ and IFN-γ/IL-4 were positively correlated with the clinical Binet stages in first visit CLL group. ConclusionWith the progression of disease, the ratio of TGF-β/IL-17 and IFN-γ/IL-4 were changed in CLL patients., With the progression of the disease， the ratio of TGF-β/IL-17 increased gradually, and the ratio of IFN-γ/IL-4 decreased gradually. The ratio of TGF-β/IL-17 and IFN-γ/IL-4 might be one of the evaluation index for disease progression and prognosis of in patients with CLL.

Keywords:chronic lymphocytic leukemia(CLL)； TGF-β/IL-17； IFN-γ/ IL-4； progression；prognosis

[收稿日期：2015-11-11]

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2016.02.021

中图分类号：R733.7

文献标识码：A

文章编号：1009-5551(2016)02-0210-05

作者简介：张瑞(1989-)，女，在读硕士，研究方向：恶性血液疾病诊断及治疗。通信作者：曲建华，女，博士，教授，主任医师，硕士生导师，研究方向：恶性血液疾病，E-mail:jhuaqu@163.com。

基金项目：新疆维吾尔自治区自然科学基金(2013211A100)