氨基甾体Z1对MEG-01白血病细胞的抑制增殖及诱导分化作用

周　阳　张　君　李　震　何　群



·基础研究·

氨基甾体Z1对MEG-01白血病细胞的抑制增殖及诱导分化作用

周阳张君李震何群

【摘要】目的观察氨基甾体Z1对人慢性粒细胞白血病MEG-01细胞的抑制增殖和诱导分化作用。方法采用液体培养实验、集落培养实验、MTT实验观察氨基甾体Z1对MEG-01细胞的抑制增殖作用；采用Wright染色、AS-D NAE染色、细胞膜CD41表面标记物检测氨基甾体Z1对MEG-01细胞的诱导分化作用。结果10-8～10-4mol/L的氨基甾体Z1连续作用后，细胞和集落计数明显减少，处理组MTT值显著降低，且呈浓度依赖；Wright染色显示处理组细胞有分化表现，AS-D NAE染色A值升高(P<0.01)，流式细胞术检测处理组细胞膜上CD41表面标记表达阳性率为76%。结论氨基甾体Z1能显著抑制MEG-01细胞增殖并诱导其向巨核细胞系分化，提示该药或可成为慢性粒细胞白血病的一种新型诱导分化剂。

【关键词】氨基甾体，MEG-01细胞，增殖分化，白血病

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:175～178)

慢性粒细胞白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)是造血系统常见的恶性克隆增生性疾病。本实验室以往的工作证实[1-2]，氨基甾体类化合物能有效地抑制WEHI-3B、HL-60、K562白血病细胞系的增殖，并诱导其向单核系或红系分化。本实验采用氨基甾体Z1作用于人慢性粒细胞白血病MEG-01细胞，观察该药物对MEG-01细胞增殖分化的影响，为白血病药物治疗新方向提供实验依据。

1材料与方法

1.1　材料

1.1.1细胞系MEG-01细胞株来自一位CML患者成巨核细胞转换期的骨髓细胞，酸性磷酸酶阳性，碱性磷酸酶阴性，Ph染色体阳性。由湘雅医学院血液生理研究室保存。用含10%热灭活小牛血清的RPMI1640置37 ℃、5%CO2饱和湿度下培养，每4～5 d换液1次。

1.1.2试剂RPMI1640培养基为Invitrogen公司产品，小牛血清购自北京鼎国生物公司。氨基甾体Z1由本实验室何群教授合成。MTT为AMRESCO公司产品。瑞氏染料1 g加入600 ml甲醇配成瑞氏染剂。醋酸AS-D萘酚、监牢蓝B盐购自北京鼎国生物公司。FITC标记的鼠抗人CD41单克隆抗体购自深圳晶美生物公司。

1.2　方法

1.2.1细胞培养取指数生长期MEG-01细胞以1.0×105个/ml终浓度加入到10 ml含10%小牛血清的1640培养液(培养体系)中，处理组调整加入终浓度为10-4～10-8mol/L的氨基甾体Z1，对照组加入等量DMSO。每孔1 ml接种于24孔板，每组平行种3孔。置37 ℃、5%CO2饱和湿度下培养5 d，每天计数活细胞数目。实验重复3次。

1.2.2集落培养取指数生长期MEG-01细胞以终浓度1.0×105个/ml加入到体外半固体培养体系中(含30%小牛血清，0.9%甲基纤维素)，处理组调整加入终浓度为10-4～10-8mol/L的氨基甾体Z1，对照组加入等量DMSO。每孔0.5 ml接种于24孔板，每组平行种3孔，置37 ℃、5%CO2饱和湿度下培养8 d后，置倒置显微镜下计数大于50个细胞的集落，并显微照相。实验重复3次。

1.2.3MTT检测取指数生长期MEG-01细胞以1.0×105个/ml终浓度加入培养体系，处理组加入终浓度为10-4～10-8mol/L的氨基甾体Z1，对照组加入等量DMSO。每孔200 μl接种于96孔板，每组平行种3孔。置37 ℃、5%CO2饱和湿度下培养5 d后离心，去上清，每孔加入5 g/L的MTT 20 μl及PBS 100 μl，37 ℃、5%CO2饱和湿度下继续培养4 h后离心，去上清，加入150 μl DMSO，充分震荡，用酶标仪(美国BioTek，ELx800UV)检测各孔A值，波长492 nm。实验重复3次。

1.2.4Wright染色取指数生长期MEG-01细胞以1.0×105个/ml终浓度加入到培养体系，处理组加入终浓度为10-6mol/L的氨基甾体Z1，对照组加入等量DMSO。置37 ℃、5%CO2饱和湿度下培养5 d后，收集细胞，涂片做Wright染色，油镜下观察细胞形态并显微照相。

1.2.5醋酸AS-D萘酚酯酶染色(AS-D NAE) 取指数生长期MEG-01细胞以1.0×105个/ml终浓度加入到培养体系，处理组加入终浓度为10-4～10-8mol/L的氨基甾体Z1，对照组加入等量DMSO，于37 ℃、5%CO2饱和湿度下培养5 d。第5 d离心收集细胞，将细胞分别置于20 ml孵育液(含PBS，PH7.4磷酸盐缓冲液，醋酸AS-D萘酚10 mg，丙酮液0.25 ml，监牢蓝B盐20 mg)中，37 ℃水浴10 min，离心，悬浮。荧光分光光度计570 nm下进行检测。

1.2.6流式细胞术取指数生长期MEG-01细胞以1.0×105个/ml终浓度加入到培养体系，处理组加入终浓度为10-6mol/L的氨基甾体Z1，对照组加入等量DMSO。置37 ℃、5%CO2饱和湿度下培养5 d后，收集106个细胞。PBS洗涤细胞3次，加入FITC标记的鼠抗人CD41单克隆抗体，4 ℃避光反应30 min，再用PBS洗涤细胞3次，流式细胞仪检测。

1.3　统计学处理

2结果

2.1　细胞增殖指标检测结果

2.1.1氨基甾体Z1对MEG-01细胞液体培养的影响加入10-8～10-4mol/L的氨基甾体Z1连续培养5 d，随着药物浓度增大，MEG-01细胞生长抑制越明显。说明氨基甾体Z1对MEG-01细胞生长呈浓度依赖性抑制(表1，图1)。

组别MEG-01细胞数(×104/ml)d0d1d2d3d4d5对照组10.00±0.0012.92±1.4919.14±0.9435.11±3.1272.72±5.69107.92±4.97氨基甾体浓度 10-8mol/L10.00±0.0012.31±1.9215.79±0.84**22.86±4.10**33.04±5.89**42.56±3.92** 10-7mol/L10.00±0.0011.60±1.47*14.71±0.83**20.36±3.21**31.57±11.37**40.93±12.24** 10-6mol/L10.00±0.0011.88±1.3214.03±0.57**19.04±1.95**28.11±4.99**37.04±7.39** 10-5mol/L10.00±0.0010.97±0.99**12.83±1.49**16.84±1.38**24.26±1.49**32.01±2.15** 10-4mol/L10.00±0.0010.13±0.65**11.61±0.70**11.76±0.97**12.38±1.37**12.28±0.85**

注：*表示与对照组比较P<0.05，**表示与对照组比较P<0.01。

图1　10-8~10-4mol/L氨基甾体Z1对MEG-01细胞

2.1.2氨基甾体Z1对MEG-01细胞集落产率的影响

加入10-8～10-4mol/L的氨基甾体Z1连续培养8 d后，MEG-01细胞集落产率降低，且呈一定浓度依赖性(表2)。

2.1.3氨基甾体Z1对MEG-01细胞MTT值的影响

加入10-8～10-4mol/L的氨基甾体Z1连续培养MEG-01细胞5 d，各浓度作用下的细胞GIR分别为：10-8mol/L、(50.87±11.67)%，10-7mol/L、(56.71±4.52)%，10-6mol/L、(66.60±6.37)%，10-5mol/L、(77.65±3.10)%，10-4mol/L、(94.17±3.05)%。可见，处理组细胞GIR增大，MTT值明显降低，并呈一定浓度依赖关系(表2)。

2.2　细胞分化指标检测结果

2.2.1氨基甾体Z1对MEG-01细胞形态的影响氨基甾体Z1处理MEG-01细胞5 d后Wright染色，油镜下观察。对照组细胞大部分呈圆形或椭圆形，外形不规整，胞质呈云雾状或刷状，部分有空泡，细胞核大，染色质粗细不均，部分细胞核仁大而明显。处理组细胞体积增大，核浆比例减小，细胞核不规则，核质变粗，胞质增多，浅染，核周胞质出现淡染区，有一定程度的分化表现。

2.2.2氨基甾体Z1对MEG-01细胞AS-D NAE染色的影响加入10-8～10-4mol/L的氨基甾体Z1连续培养5 d，处理组AS-DNAE染色后A570 nm值明显升高(P<0.01)，说明处理组MEG-01细胞有向巨核系成熟方向分化的表现(表2)。

2.2.3MEG-01细胞膜CD41表面标记表达的检测流式细胞仪分析显示，终浓度为10-6mol/L的氨基甾体Z1作用于MEG-01细胞5 d后，MEG-01细胞膜上CD41表面标记表达阳性率为76%，说明该化合物可诱导MEG-01细胞向巨核系分化(图2)。

A为对照组；B为10-6mol/L氨基甾体Z1处理组。

3讨论

造血干细胞增殖与分化的失平衡是白血病发生的重要原因，近年来的药物研究着力于寻找能诱导白血病细胞向正常细胞分化的药物，此类药物的特点是不杀死肿瘤细胞，而是诱导其向成熟细胞分化，以达到治疗效果。上世纪60年代，Piercet首先发现小鼠睾丸畸胎瘤细胞可以自发地分化成良性的正常细胞[3]，证实了通过诱导肿瘤细胞分化来治愈恶性肿瘤的假设，开创了恶性肿瘤的分化诱导研究。随后，我国的王振义教授应用全反式维甲酸治疗急性早幼粒细胞白血病，患者完全缓解率达72%[4]，其作用机制就是该药能诱导白血病细胞的分化和凋亡。这一报道开创了临床应用诱导分化剂治疗白血病的先河。2001年5月美国食品和药物管理局(food and drug administration，FDA)批准酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor，TKI)Gleevec为治疗新诊断慢粒的第一线药物，作为1种有效的基因靶向药物在CML的治疗上开辟了一条新的途径，目前该药在临床药物治疗中仍占有重要地位[5]。在成功案例的启发下，经过国内外学者的努力探究，至今全球已发现和合成各类诱导分化剂80余种，并有30多种获准应用于临床[6]。

甾体是具有广泛生物活性的一类物质，甾体类化合物不仅在正常细胞的生长代谢，红细胞的氧化损伤，脏器缺血再灌注的修复和神经的修复过程中起到重要的作用，而且对肿瘤细胞的增殖、分化也有着重要的调节作用[7-8]。氨基甾体是一类新合成的化合物，被美国《化学文摘》确定为国际上首次合成的新化合物，并已确证该类化合物具有诱导白血病细胞分化、抑制增殖的作用，而且发现其具有独特的作用机理，对正常的造血细胞毒副作用较小。

本实验显示氨基甾体Z1作用后，MEG-01细胞的液体培养和集落生成均被明显抑制，药物处理后MTT检测不同浓度下GIR也有明显升高，可见5种浓度的氨基甾体Z1对MEG-01细胞都有抑制增殖的作用且呈一定的浓度依赖关系。本实验还证实氨基甾体Z1对MEG-01细胞有一定的诱导分化作用。终浓度为10-6mol/L的氨基甾体Z1作用于MEG-01细胞5 d后，做细胞涂片，油镜下观察细胞呈现一定程度的分化表现。原始粒细胞中的醋酸AS-D萘酚酯酶含量极低，随着细胞向巨核系成熟方向发展，胞质中的醋酸AS-D萘酚酯酶含量逐渐升高。因此，AS-D NAE染色能在一定程度上反应巨核系细胞的分化成熟情况。处理组细胞经AS-DNAE染色，荧光强度值明显升高，说明氨基甾体Z1能诱导MEG-01细胞向巨核系成熟方向分化。CD41又称GP Ⅱb或αⅡ β整合素，是1种相对分子量为14 kD的膜糖蛋白，在巨核细胞和血小板细胞膜上特异表达。流式细胞仪分析结果显示经10-6mol/L的氨基甾体Z1作用5 d后，MEG-01细胞膜上CD41表面标记表达上调，证明MEG-01细胞有向巨核系分化成熟的倾向。

组别 集落数①A492nm②A570nm③对照组349.11±18.760.554±0.020.015±0.002氨基甾体浓度 10-8mol/L297.33±13.08**0.272±0.06**0.078±0.045** 10-7mol/L281.56±17.94**0.240±0.03**0.105±0.002** 10-6mol/L225.44±35.88**0.185±0.04**0.159±0.005** 10-5mol/L92.67±13.14**0.123±0.01**0.222±0.014** 10-4mol/L2.89±4.68**0.032±0.02**0.304±0.040**

注：①不同浓度氨基甾体Z1处理细胞8 d，集落数/0.5 ml体系；②不同浓度氨基甾体Z1处理细胞5 d，MTT实验酶标仪所测A492 nm值；③不同浓度氨基甾体Z1处理细胞5 d，AS-D NAE染色实验荧光分光光度计所测A570 nm值;**为与对照组比较，P<0.01。

综上所述，氨基甾体Z1可以有效地抑制MEG-01细胞的增殖，并能诱导其向巨核系分化。

参考文献

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[2]张君，周阳，何群.氨基甾体H42649对K562白血病细胞的抑制增殖和诱导分化作用〔J〕.解剖学研究，2012，34(3)：215-219.

[3]Pierce GB Jr,Dixon FJ Jr,Verney EL.Teratocarcinogenic and tissue-forming potentials of the cell types comprising neoplastic embryoid bodies〔J〕.Lab Invest,1960,9:583-602.

[4]Huang ME,Ye YC,Chen SR,et al.Use of all-trans retinoic acid in the treatment of acute promyelocytic leukemia〔J〕.Blood,1988,72(2):567-572.

[5]Santorsola D,Abruzzese E.Successful Management of P-

regnancy and Hepatic Toxicity in a CML Female Patient Treated with Nilotinib:a Case Report and a Review〔J〕.Mediterr J Hematol Infect Dis，2015,7(1):e2015020.

[6]Jiang GS.Induction of committed differentiation and target immunotherapy of patients with hematopoietic malignancy〔J〕.Chin J Cancer Biother,2010,17(6):589-596.

[7]Sharifi S,Dzik WH,Sadrzadeh SM.Human plasma and Tirilazad mesylate protect stored human erythrocytes against the oxidative damage of gamma-irradiation〔J〕.Transfusion Medicine,2000,10(2):125-130.

[8]Gonzalez Deniselle MC,Gonzalez SL,De Nicola AF.Cellular basis of Steroid neuroprotection in the wobbler mouse,a genetic model of motoeuron disease〔J〕.Cell Mol Neurobiol,2001,21(3):237-254.

(编辑：吴小红)

Proliferation-inhibiting and Differentiation-inducing Effects of Aminosteroid Z1 on

MEG-01 Leukemia Cells

ZHOUYang,ZHANGJun,LIZheng,etal.Hu'nanUniversityofMedicine,Huaihua,418000

【Abstract】ObjectiveTo explore the proliferation-inhibiting and differentiation-inducing effects of aminosteroid Z1 on human chronic myelogenous leukemia MEG-01 cells.MethodsLiquid culture,colony culture and MTT assay were used to detect the proliferation.Meanwhile,morphology,AS-D NAE stain and flow cytometry were adopted to measure the differentiation.Results

The number of MEG-01 cells and colony was decreased sufficiently after the constant treatment with 10-8~10-4mol/L aminosteroid Z1,and the MTT assay was decreased in a dose-dependent manner.The cells with Wright stain treatment had an obvious differentiation.The A figure of AS-D NAE stain increased and the positive rate of CD41 cell-surface marker on cytomembrane in flow cytometry reached 76%.ConclusionAminosteroid Z1 can effectively inhibit the differentiation of MEG-01 cells and induce them to differentiate into megakaryocytic lineage.It indicates that this kind of medicine may become a new differentiation inducer for chronic myelogenous leukemia.

【Key words】Aminosteroid；MEG-01 cell；Proliferation and differentiation；Leukemia

(收稿日期2015-03-19修回日期 2015-09-17)

中图分类号：R733.7

文献标识码：A

文章编号：1001-5930(2016)02-0175-04

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.02.001

通讯作者：何群

基金项目：国家自然科学基金(编号：39970316)
作者单位:418000 湖南医药学院基础医学院