广西地区汉族人群PRKCB1基因-546C/G多态性与糖尿病肾病易感性相关性研究



广西地区汉族人群PRKCB1基因-546C/G多态性与糖尿病肾病易感性相关性研究

李轶春1,岑文新2,肖玲3

(广西壮族自治区北海市中医医院 1.检验科;2.肾内科;3.糖尿病专科，广西 北海536000)

糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy, DN)是糖尿病(Diabetes mellitus, DM)微血管并发症之一，在2型糖尿病患者中，其致残、致死率仅次于大血管并发症。据统计，病程超过25年以上的糖尿病肾病累积患病率高达25%-40%，也是我国导致终末肾功能衰竭的第2位病因[1]。其病因和发病机制尚未完全明了，可能与环境因素和遗传因素有关。蛋白激酶Cβ(PKC-β)是细胞内信号传递关键分子之一，激活后通过改变肾脏血流动力学、增厚肾小球毛细管基底和细胞外基质进行性积聚、加大血管炎症反应、增加血管通透性等方式参与糖尿病肾病的发生与发展[2][3]，因此蛋白激酶Cβ(PKC-β)基因PRKCB1基因可能是诱发DN的相关基因。本文选择120例广西汉族人群为研究对象，对PRKCB1基因启动子-546C/G基因型、等位基因频率进行比较分析，旨在探讨广西汉族人群PRKCB1基因-546C/G多态性分布、及与糖尿病病肾病易感性相关性。

1对象与方法

1.1研究对象

选取2012年1月-2013年5月在广西北海中医院内分泌科、肾内科2型糖尿病患者，均为汉族人。彼此此无血缘关系。均符合2010年《中国2型糖尿病防治指南》[4]诊断和分型标准，并根据尿微量白蛋白排泄率(UARE)分为糖尿病非肾病组(NDN)42例、糖尿病肾病组(DN)38例。同期选择健康体检人群43例。排除血糖控制不稳定、心肺功能不全、肾功能不全、1个月内服用影响尿蛋白排泄药物者。

1.2方法

1.2.1生物指标检测所有研究对象均于清晨8：00抽取静脉血6 ml，分装于普通试管和乙二胺乙酸EDTA抗凝试管中，一份送特殊化室检测，另一份于25 cm、3 000 r/min离心15 min，取血细胞部分存于是-70℃冰箱中待检，同时检测尿液中尿白蛋白排泄率。

1.2.2基因组DNA提取取出置于-70℃冰箱血细胞，常温解冻，利用MassARRAY Assay(质谱阵列)高通量检测平台进行检测分析，PCR引物参考基因库PRKCB1进行设计，由上海生工合成，片段长度150 bp，上游引物：5’-AGGCAAGCAAAGCCAAGA-3’；下游引物：‘’-GCTCCCGCTGTCACTCATT-3’。反应体系：10XPCR Buffer5.0 μl，dNTPmix4.0 μl,DNA模板2.5 μl，上游引物1.0 μl，下游引物1.0 μl，Pfu酶0.4 μl，灭菌三蒸水36.1 μl；反应条件：97℃预变性5 min，97℃变性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40个循环，扩增产物5 μl与150 bp DNA Ladder Marker加样于2%琼脂糖凝胶上，80V恒压电泳30 min，在紫外灯下观察PCR产物和150 bp Marker迁移率相同，则可判定为所需片段(见图1)，余PCR产物采用DNA Extraction Kit纯化。

图1　PCR扩增PRKCB1-546产物位点电泳图

1.3数据分析

2结果

2.13组病例临床、生化指标比较

3组病例性别、年龄比较差异无统计学意义；NDN组与DN组FBG、PBG、TG、HbA1c、Bun明显高于对照组；DN组PBG、TC、TG、HbA1c、Bun、Cr、LnUAER明显高于NDN组；HDL-C、LDL-C明显低于NDN组，见表1。

表1　3组病例临床、生化指标比较

备注：与正常对照组比较，*P<0.05；ND组与NDN组比较，#P<0.05。FBG：空腹血糖；PBG：餐后2 h血糖；TC：总胆固醇；TG：甘油三脂；HbAlc：糖化血红蛋白；HDL-C：高密度脂蛋白胆固醇；LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇；Bun：尿素氮；Cr：肌酐；LnUAER：尿微量白蛋白排泄量的自然对数。

2.23组病例基因型与基因频率比较

3组间PRKCB1基因-546均存在CC、CG、GG 3种基因型和C、G两种等位基因，均符合Hardy-Weinberg平衡，提示样本具有群体代表性。NDN组与正常对照组基因型和等位基因频率比较差异无统计学意义；DN组CC基因型、C等位基因频率明显低于正常对照组、NDN组(χ2=6.125、5.642，P<0.05)；DN组GG基因型、G等位基因频率显著高于正常对照组、NDN组(χ2=9.364、11.684，P<0.01)，见表2。

表2　3组病例基因型与等位基因频率比较[n(%)]

2.3糖尿病肾病风险因素回归分析

以DN患者与否为因变量，以性别、FBG、PBG、TC、TG、HbA1c、Bun、Cr、LnUAER、HDL-C、LDL-C、PRKCB1为自变量进行多因素回归分析，结果表明，PRKCB1-546GG基因型患者发生DN风险为CC基因型患者3.568倍，CG基因型发生DN风险为CC基因型1.882倍，TC、HbA1c也共同影响DN的发生发展，见表3。

表3　糖尿病肾病风险因素Logistic回归分析

3讨论

蛋白激酶C(PKC-β)分子量为67-83KD，属于丝氨酸激酶家庭中的一员，均为单链多肽，PRKCB1基因编码PKC-βⅠ、PKC-βⅡ定位于16p11.2，全长375 kb，目前已知有9个单核苷酸多态性(SNP)，-546C/G 单核苷酸多态性是6个位于启动子之一[5]。美国学者[6]研究报道，对于病程<24年的糖尿病患者，PRKCB1基因启动子-546C/G携带G等位基因诱发糖尿病肾病的危险性更大(95%CI：1.37-4.38)；日本学者[7]通过长达6年的前瞻性研究报道，在正常蛋白尿及微量白蛋白尿2型糖尿病患者中，PRKCB1基因启动子-546C/G携带G等位基因患者eGFR下降速度更加明显(-2.96±0.62 VS -1.63±0.15)ml/min，且更易进展到终末期肾病，因此提出PRKCB1基因多态性作为日本2型糖尿病肾病患者进展的预测指标。从现有文献资料分析，我国目前鲜见，PRKCB1基因启动子-546基因多态性与糖尿病肾病的相关性研究，这也是本课题研究的出发点。

本文研究中，3组间PRKCB1基因-546均存在CC、CG、GG 3种基因型和C、G两种等位基因，其分布均符合Hardy-Weinberg平衡，提示样本具有群体代表性。DN组CC基因分布明显低于正常对照组、NDN组，G等位基因频率显著高于正常对照组、NDN组，且正常对照组与糖尿病非肾病组之间没有统计学意义，提示PRKCB1基因多态性与糖尿病无关，而与糖尿病肾病相关，也提示G等位基因是糖尿病肾病的危险因素，C等位基因是糖尿病肾病的保护因素。国外学者分析-546C/G SNP可能影响到PRKCB1的转录，转录因素在糖尿病状态下参与了糖尿病肾病并发平的发生[8,9]。通过以性别、FBG、PBG、TC、TG、HbA1c、Bun、Cr、LnUAER、HDL-C、LDL-C、PRKCB1为自变量进行多因素回归分析研究表明，PRKCB1-546GG、CG基因型患者发生DN风险为CC基因型患者3.568、1.882倍，进一步证实了PRKCB1-546GG、CG基因是2型糖尿病肾病的危险因素。研究同时表明，TC、HbA1c也共同影响DN的发生发展。国内外学者不同的研究结果也均表明控制血糖能够降低糖尿病微血管并发症的发生[10,11]。

综上所述，广西汉族人群PRKCB1基因启动子-546位存在CC、CG、GG基因型和C、G等位基因，CG型基因、G等位基因为糖尿病肾病的危险因素，CC型基因、C等位基因为糖尿病肾病的保护因素。

参考文献：

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[4]中华医学会糖尿病学分会.中国2型糖尿病防治指南(基层版)[J].中华全科医师杂志，2013，12(8)：675.

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(收稿日期：2015-01-09)

文章编号：1007-4287(2016)01-0094-03 1007-4287(2016)01-0097-02

基金项目：编号：201206003;北海市科技局