家蚕生物反应器共表达猪α+γ干扰素的生产研究

丁 农， 张金卫， 李江涛， 鱼南洋， 冯世民， 沈建华， 徐森华

(湖州市农业科学研究院，浙江湖州 313000)



家蚕生物反应器共表达猪α+γ干扰素的生产研究

丁 农， 张金卫， 李江涛， 鱼南洋， 冯世民， 沈建华， 徐森华

(湖州市农业科学研究院，浙江湖州 313000)

近年来，随着基因工程技术的发展，家蚕生物反应器(家蚕BmNPV杆状病毒表达载体系统)生产转基因生物活性物质的良好特性被生物学家所认识，许多基因工程产品通过家蚕这一优良生物反应器得到表达，家蚕生物反应器成为免疫学和基因工程真核生物表达系统等研究领域的重大进展之一[1]。采用家蚕生物反应器技术成功地表达了乙肝表面抗原的M蛋白基因[2]、丙肝病毒核心蛋白[3]、类胰岛素样生长因子-1[4]、禽马立克氏病毒糖蛋白B抗原[5]、口蹄疫疫苗抗原[6-7]等产品，其中有的已经产业化，具有广阔的应用前景和巨大的社会经济效益。

干扰素(Interferon,IFN)是人和动物细胞受到特定干扰素诱生剂刺激后，由巨噬细胞、淋巴细胞等产生的一种具有多种生物学活性的糖蛋白。干扰素具有广谱抗病毒、抗肿瘤和免疫增强等多种生物活性，具备无休药期、无药残、无毒副作用、不产生耐药性、可反复使用的优点，为目前最理想的一种抗病毒生物制剂。干扰素IFN-α和干扰素IFN-γ联合使用具有协同作用，比单独使用其中一种具有更强的抗病毒效果[8-9]。因此，利用基因工程技术制备含有猪干扰素α和猪干扰素γ的复合型干扰素对防治猪的病毒性疾病具有重要意义。

中国农业科学院生物技术研究所成功研究出猪的α干扰素基因和γ干扰素基因重组家蚕杆状病毒共表达载体rBmNPV(BmIFN-α+γ)，并取得了发明专利，可以将猪α干扰素基因和γ干扰素基因在家蚕杆状病毒生物反应器中联合表达或共表达，所表达的重组α干扰素产物和重组γ干扰素之间具有协同增效作用，能够提高重组干扰素产物的效价及稳定性[10-11]。笔者采用该共表达载体，研究以家蚕为生物反应器规模化共表达猪α+γ干扰素的生产应用中存在的相关技术问题，以期为家蚕生物反应器规模化共表达猪α+γ干扰素生产提供技术支持。

1材料与方法

1.1试验材料 rBmNPV(BmIFN-α+γ)重组病毒培养液由中国农业科学院生物技术研究所提供，在4 ℃条件下保存备用。α干扰素ELISA检测试剂盒由德国IBL公司生产，上海将来实业有限公司提供；试验用蚕品种由湖州市农业科学研究院保存饲养，规模化生产试验用蚕茧由安吉县良棚镇黄金村和南浔区菱湖镇射中村分别生产提供，酶标仪和10万级无菌净化车间等仪器设备由湖州市农业科学研究院提供。

1.2试验方法

1.2.1共表达干扰素重组杆状病毒rBmNPV(BmIFN-α+γ)的接种注射。蚕蛹接种注射前剔除坏死、败血和蝇蛆等不健康蚕蛹，然后用0.3%的次氯酸钙进行蛹体浸渍消毒凉干；rBmNPV(BmIFN-α+γ)重组病毒按105pfu /头(5 μl/头)接种蚕蛹，置于25～26 ℃下表达4.5 d，收集发病蚕蛹，于-20 ℃冷冻保存供检测。

1.2.2共表达干扰素重组杆状病毒rBmNPV(BmIFN-α+γ)表达量的检测。采用α干扰素ELISA检测试剂盒，以IFN-α表达量来说明IFN-α+γ的表达量。按雌雄1∶1的比例随机抽取20头蚕蛹，匀浆机研磨蛹体，离心取上清液，按照试剂盒说明书进行表达量检测。其原理：应用双抗体夹心法测定样本中猪IFN-α的水平。用纯化的猪IFN-α抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入IFN-α，再与HRP标记的IFN-α抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的IFN-α呈正相关。用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度(OD值)，通过标准曲线计算样品中猪IFN-α含量。

1.2.3共表达干扰素(BmIFN-α+γ)规模化生产用蚕品种的选择。选择湖州市农村推广应用的春用多丝量品种菁松×皓月(正反交)和夏秋用中丝量秋丰×白玉(正反交)进行猪rBmNPV(BmIFN-α+γ)表达量的测试，以选择规模化应用的农村推广品种，采用表达量高的品种作为规模化生产应用品种。

1.2.4手工接种与机械接种对干扰素重组杆状病毒rBmNPV(BmIFN-α+γ)表达效率的影响。采用湖洲市农业科学研究院生产的专利产品蚕蛹集团注射机器[12]注射与手工注射进行工作效率与产品表达效率的比较，以了解采用机械注射生产的可行性和优势。供试品种为皓月×菁松，注射剂量相同为105pfu /头(5 μL/头)，机器按4人标准配制，其中3人放蛹，1人操作机器注射，对照为4人进行手工注射蚕蛹，工作时间定为7.0 h(上午、下午各3.5 h)。

1.2.5蚕蛹注射接种干扰素重组杆状病毒rBmNPV(BmIFN-α+γ)适期的确定。采用皓月×菁松蚕品种从熟蚕上蔟开始于25 ℃保护，在上蔟的第4天起即化蛹的第1～10天每天连续接种注射200头健康蛹，注射接种后的蚕蛹于25 ℃保护7 d，调查注射蚕蛹的细菌败血病死亡率、化蛾率(有变态形状不能羽化死亡的也计入化蛾头数)及接种成功率。

1.2.6蚕蛹的冷藏对重组杆状病毒rBmNPV(BmIFN-α+γ)表达量的影响。将供试蚕儿上蔟结茧后于25 ℃保护6 d为冷藏起始日，分别于冷柜(4～5 ℃)冷藏5、10和15 d时将蚕茧削茧取蛹，然后手工注射干扰素重组杆状病毒rBmNPV(BmIFN-α+γ)，检测表达效率，以未经冷藏的蚕蛹接种作为对照。

2结果与分析

2.1共表达干扰素(BmIFN-α+γ)规模化生产用蚕品种检测结果表明，菁松×皓月、皓月×菁松、秋丰×白玉、白玉×秋丰的IFN表达量为710.61、805.69、577.49和592.12 ng/L。由此可知，品种间对重组杆状病毒rBmNPV(BmIFN-α+γ)的表达效率差异较大，春用品种以皓月×菁松为好，夏秋用品种以白玉×秋丰为好。

2.2手工接种与机械接种对干扰素重组杆状病毒rBmNPV(BmIFN-α+γ)表达效率的影响对采用该设备的生产效率及产品表达量与手工注射生产方式进行了比较。由表1可知，机器注射共接种蚕蛹16 744颗/(d·人)，手工注射共接种蚕蛹4 102颗/(d·人)，机械注射接种效率提高了3倍以上，检测产品表达量相差不大，说明在保准产品质量的前提下，机械注射接种可以大幅度提高工作效率。

表1手工接种与机械注射对生产效率及猪干扰素基因(BmIFN-α+γ)表达量的影响

Table 1Expression comparison of production efficiency and porcine interferon gene (BmIFN-α+γ)

注射接种方式Injectionmethod注射蚕蛹头数Numberofinjectedsilkwormchrysalis颗/(d·人)工效指数EfficiencyindexIFN表达量IFNexpressionng/L手工注射接种Manualinjection4102100826.09机械注射接种Mechanicalinjection16744408823.24

2.3重组杆状病毒rBmNPV(BmIFN-α+γ)的蚕蛹注射适期由表2可知，过早注射因蚕蛹太嫩容易出血，增加细菌感染机会，造成损失，接种成功率低，而过迟注射蛹体内容物已形成各种器官，不利于重组杆状病毒的繁殖，化蛾率大幅度提高，接种成功率低。从调查结果看，在蚕上蔟后25 ℃保护，第5～9天是注射适期，以第6～8天为最佳，蚕品种不同或蚕茧保护温度不同在注射适期上会略有差异。

表2　重组杆状病毒rBmNPV(BmIFN-α+γ)的注射适期

2.4蚕蛹的冷藏对重组杆状病毒rBmNPV(BmIFN-α+γ)表达量的影响由图1可知，将蚕茧冷藏于4～5 ℃,冷藏5与10 d的表达量与未经冷藏处理蚕蛹的表达效率差异不大，而冷藏15 d的表达量显著下降。因此在规模化生产时如遇到蚕蛹接种注射速度与劳动力紧张的突出矛盾时，可以将蚕茧冷藏于4～5 ℃ 10 d以内，对重组杆状病毒rBmNPV(BmIFN-α+γ)在蚕蛹中的表达效率影响不大，在规模化生产中可以利用冷藏来延长蚕蛹接种适期。

图1　不同时间冷藏蚕蛹的重组杆状病毒rBmNPV(IFN-α+γ)表达量Fig. 1　Expression quantity of recombinant baculovirus rBmNPV(IFN-α+γ) in silkworm chrysalis under different cold storage days

3小结与讨论

该试验采用中国农业科学院生物技术研究所研究成果猪的α干扰素基因和γ干扰素基因重组家蚕杆状病毒共表达载体rBmNPV(BmIFN-α+γ)，研究利用家蚕(蚕蛹)生物反应器进行规模化生产的相关技术。结果表明，蚕品种对猪干扰素基因(IFN-α+γ)的表达效率差异较大，皓月×菁松的表达效率高于其他品种，因此选择高表达效率的蚕品种是提高生产效率的有效手段。注射接种是一项劳动力密集型的工作，且技术要求高，该试验采用机器注射平均每天人均注射接种量比手工注射提高了3倍以上，且对产品表达量无影响，该机械把注射器的消毒、清洗、加药、蚕蛹接种等步骤在机械上逐一完成，标准容易制定和控制，有利于规模化和标准化生产，提高工作效率和降低生产成本。从该试验结果看注射接种的最佳时间以蚕上蔟的第6～8天为最佳，最佳注射时间的短促为规模化生产带来很大不便，通过冷藏蚕蛹的生产试验显示在4～5 ℃冷藏10 d对重组杆状病毒rBmNPV(BmIFN-α+γ)在蚕蛹中的表达效率影响不大，因此在规模化生产上可以通过冷藏蚕茧的方式来延长蚕蛹接种适期。2015年春秋蚕期，采用上述的试验结果成功进行了生产1 t鲜茧规模的共表达基因工程产品猪α+γ干扰素的试生产，春用品种采用皓月×菁松，夏秋用品种采用白玉×秋丰，生产得率为55%～60%，即1 t鲜茧可生产猪α+γ干扰素共表达蚕蛹0.55～0.60 t。实践证明只要在生产上将适合不同季节饲养的蚕品种合理运用，蚕期养蚕收蚁时间作合理的安排以及结合机械的使用和规范操作可以确保规模化生产的成功。

参考文献

[1] 张耀洲，吴祥甫.家蚕生物反应器[M].杭州:浙江大学出版社，2008.

[2] 杨瑞丽，任学毅，赵秀玲，等.家蚕蛹表达乙肝表面抗原中蛋白免疫原性的研究[J].农业生物技术学报，2002,10(4):359-362.

[3] 曹广力，华刚，张志芳，等.应用重组家蚕核多角体病毒在蚕体中表达人丙型肝炎病毒C区及E1区基因[J].蚕业科学，1999，25(4)：230-236.

[4] 张志芳，何家禄.应用家蚕杆状病毒生物反应器生产人类胰岛素生长因子口服药物的方法：中国，ZL02112766.2[P].2008-11-26.

[5] 肖庆利，季平，何家禄，等.禽马立克氏病毒糖蛋白B基因在家蚕中的表达[J].蚕业科学，1997,23(2):104-108.

[6] 张韵，易咏竹，李志勇，等.O型口蹄疫P1-2A3C基因在家蚕杆状病毒表达系统中的表达[J].蚕业科学，2008，34(1):148-153.

[7] 张韵，张金卫，易咏竹，等.Asia I口蹄疫病毒组合基因P1-2A3C在不同家蚕品种中的表达[J].安徽农业科学，2011，39(33)：20490-20491,20510.

[8] 张小楠.干扰素α与干扰素γ联合处理加强抗病毒效应分子机理初步研究[D].上海：复旦大学，2006.

[9]王彦彬，孙向丽，魏战勇，等.猪干扰素α和γ在杆状病毒中共表达及对PRRSV抑制作用[J]. 中国农业科学，2011，44(9)：1931-1938.

[10] 钟鲁龙.猪干扰素α和γ在家蚕中的共表达[D].北京：中国农业科学院，2013.

[11] 张志芳，李金祥，李轶女，等. 动物α干扰素和γ干扰素的表达方法:中国，ZL2012101105336[P].2014-11-19.

[12] 鱼南洋，丁农，张金卫，等. 昆虫蛹集团注射机[P]:中国，ZL200920113230.3.2011-05-18.

摘要[目的] 研究家蚕生物反应器规模化共表达基因工程产品猪α+γ干扰素的关键技术，为家蚕生物反应器规模化共表达猪α+γ干扰素的生产提供技术支持。[方法]采用α干扰素ELISA检测试剂盒检测蚕品种、接种方式、蚕蛹冷藏对共表达干扰素重组杆状病毒rBmNPV(BmIFN-α+γ)表达量的影响。 [结果]不同蚕品种对重组杆状病毒的表达效率差异较大，春用品种选择皓月×菁松，夏秋用品种选择白玉×秋丰。机械注射接种效率比手工注射提高了3倍以上，检测产品表达量相差不大。蚕在上蔟后25 ℃保护，第5～9天是注射适期，以第6～8天为最佳。蚕茧冷藏于4～5 ℃ 10 d以内，对重组杆状病毒在蚕蛹中的表达效率影响不大。[结论]采用高表达效率的蚕品种以及结合机械的使用和规范操作可以确保规模化生产的成功。

关键词家蚕生物反应器；共表达；猪；α+γ干扰素

Productive Study of Silkworm Bioreactor Porcine Co-expression α+γ Interferon

DING Nong, ZHANG Jin-wei, LI Jiang-tao et al (Huzhou Academy of Agricultural Sciences, Huzhou, Zhejiang 313000)

Abstract[Objective] To study the key technologies of silkworm bioreactor large scale porcine co-expression α+γ interferon, and provide technical support for the production of silkworm bioreactor large scale porcine co-expression α+γ interferon. [Method]α interferon ELISA testing kits were used for testing the effects of silkworm varieties, inoculation methods and silkworm pupae cold storage on the amount of expression of co-expression interferon recombinant baculovirus rBmNPV (BmIFN-α+γ). [Result] Different kinds of silkworms differ largely in expression efficiency to recombinant baculovirus, with Haoyue × Jingsong higher and Qiufeng × Baiyu lower. Mechanical injection inoculation was over three times more efficient than manual, with similar expression of tested products. After mounting, the silkworms needed to be protected at a temperature of 25 ℃. The fifth to ninety day was the optimum time for injection, with the sixth to eighth the best. Cocoons were refrigerated at 4-5 ℃ for ten days, which had a little influence on the expression efficiency of recombinant baculovirus in cocoons.[Conclusion] The use of high expression efficiency silkworm varieties and the standardized use of machines can ensure the success of large scale production.

Key wordsSilkworm bioreactor；Co-expression；Porcine；α+γ Interferon

收稿日期2015-12-07

作者简介丁农(1961- )，男，浙江德清人，研究员，从事家蚕遗传育种及生物技术应用研究。

基金项目浙江省公益技术农业项目(2014C32054)；湖州市公益技术应用研究项目(2013GY09)。

中图分类号S 882.3+1

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)01-220-03