胃癌分子病理研究中基因芯片的应用进展

吴建平

(保山中医药高等专科学校，云南 保山 678000)



胃癌分子病理研究中基因芯片的应用进展

吴建平

(保山中医药高等专科学校，云南 保山 678000)

[关键词]胃癌；病理诊断；基因芯片；治疗分子机制

随着人类基因组计划的完整，研究重点开始进入到后基因组时代。基因芯片又称之为DNA微阵列，最早在20世纪由美国Fodor等提出，包括上万种寡核苷酸或者DNA样品，密集排列在聚乙烯、硅片等支撑物上，类似Southern和Northem杂交技术原因，芯片DNA与样品cDNA结合被标记，全面描述细胞所有基因，提供发育阶段信号，准确检测基因表达，并能够了解与某些生命现象相关基因表达，对基因调控研究有重要价值[1-2]。本文主要综述基因芯片技术在胃癌领域研究现状。

1基因芯片在胃癌发病机制研究中的应用

基因芯片在胃癌发病机制研究中集中表现在寻找相关基因、胃癌转移基因等方面。基因芯片能够检测基因多肽位点和基因突变，基因组多样性研究对阐明个体疾病易感性有重要价值，系统筛查基因编码序列对于查找疾病易感基因有重要价值。

基因芯片技术寻找胃癌癌变相关基因研究比较早，国内不少研究利用cDNA微阵列芯片筛选胃癌相关基因，如杨少波等[3]将人类基因PCR产物联合微阵列芯片，抽取胃腺癌和正常胃黏膜组织纯化mRNA，逆转录合成荧光分子标记作为探针，扫描芯片荧光信号，结果显示327条基因在胃腺癌表达异常，其中179条基因表达下降，其余上调，表明胃腺癌发展中由多基因调控参与。国外研究较早，Leung等[4]采用基因芯片技术检测胃癌组织基因表达情况，认为基因对胃癌的发展和转移存在一直效果，采用588个一直基因片段检测不同胃组织基因表达情况，结果发现，胃癌组织中半胱天冬酶-8前体等基因上调，基质金属蛋白酶基因下调，同时发现胃癌患者17号染色体长臂存在基因扩增情况。

苏征等[5]采用基因芯片技术筛查胃癌发生发展中差异基因表达情况，采用激光切割显微镜补货联合基因芯片技术分析正常黏膜组织和胃炎组织基因表达谱情况，结果发现慢性萎缩性胃癌与正常胃黏膜组织共包括109个差异基因，其中61个基因上调，48个基因下调，多数下调基因与肠上皮化生和不典型增生有关。Sepulveda等[6]利用cDNA微阵列检测胃癌患者基因表达，发现200个基因存在异常改变，认为幽门螺杆菌感染能够引起cyclinD1基因以及cjun基因等的上调，能够诱导丝氨酸苏氨酸激酶的表达。谢海龙等[7]同样采用cDNA微阵列芯片筛选胃癌转移相关相关基因。采用cDNA微阵列技术建立胃癌原发病灶和转移病灶基因表达谱，采用含10 000个已知基因和7000EST基因芯片分析表达谱变化，结果发现601个表达基因差异存在2倍异常，其中淋巴结转移基因中527个上调，如碳酸酐酶Ⅱ基因、EMSI基因等，74个下调，EST差异2倍以上包括71个，其中淋巴结转移病灶中62个基因表达上调，9个基因表达下调，淋巴结转移病灶，细胞周期、黏附功能等相关基因高表达。

肿瘤发生以基因结构和活性改变为基础，细胞异常增殖是主要表现。肿瘤过度增殖可能与参与细胞周期调控基因表达异常有关，细胞正常周期中，DNA合成前期和DNA合成期是关键环节，采用基因芯片技术检测此阶段胃癌细胞质基因表达情况对于阐述胃癌组织增殖机制以及治疗有很大帮助。兰斌等[8]分析胃癌组织周期表达谱变化，从基因学角度阐述胃癌组织增殖原理，采用双胸腺嘧啶核苷法等，阻断胃癌细胞株G2/M期以及G1/S期交界点，然后释放，同时采用流式细胞仪监测，基因芯片检测细胞周期中G2/M分界点以及G1/S分界点等基因表达谱，借助基因数据库，分析细胞周期G1末期和G2期基因表达情况，通过基因芯片检测， 不同时间点共得到2 001个基因，其中379个基因在G1末期和G2期出现上调，40个基因在S期和M期出现上调。G1末期上调基因包括蛋白质转运、RNA合成、转录调节等基因，指出MKN45细胞周期变化中G1末期和G2期已经完整DNA复制及染色体分离所需要的物质，这个过程中多种基因参与，部分基因表达上调可能引起细胞过度增殖。马万山等[9]采用基因表达谱芯片研究胃癌组织细胞周期和细胞凋亡相关基因，采用Trizol一步法抽取胃癌组织总RNA，分离纯化mRNA，逆转录为荧光分子标记物，与表达谱芯片杂交，分析胃癌表达异常基因，并分析生物信息学，研究结果发现，与正常胃组织基表达相比，胃癌组织细胞周期和细胞凋亡基因异常17条，其中细胞周期基因11条，细胞凋亡基因6条，胃癌组织中，10条基因表达上调，7条基因表达下降，指出胃癌发生和发展中存在错基因表达失控情况，对进一步阐述胃癌发病机制有重要意义。

恶性肿瘤表现出侵袭性和转移性，基因芯片能够提供研究肿瘤转移分子机制新方法。Ureshino等[10]利用基因芯片结合基因抑制技术提出胃癌组织中的NDRG1基因，发现胃癌组织和腹膜转移基因酶被明显抑制，指出在胃癌恶性转移中NDRG1基因发挥重要作用，同时选取GC9811和GC9811-P细菌系作为相应配型，标注Cy3和Cy5微阵列，发现覆膜转移中，248个差异表达发挥潜在作用。余晓云等[11]在分析胃癌淋巴结转移中基因芯片技术预测诊断，选取胃癌患者组织标本，使用GeneChipHuGenceFL寡核苷酸芯片畸形检测，抽取总RNA，反转录成双链cRNA，采集数据初步筛选发现，淋巴结转移和无淋巴结转移胃癌组织共包括123个差异表达基因，肿瘤血管形成相关基因包括THBS2、FN1等，信号传导基因包括HSPB1、MAP3K12等，细胞运动和黏附基因包括PFN2、CAS1等。表达下调基因基本为多种免疫因子，如CXCL2、ASS1等基因，筛选基因临床交叉验证结果表明17例与临床一致，预测胃癌淋巴结转移敏感性和特异性都较高。Natsume等[12]分析MKN74细胞中CRKL存在高度表达，采用基因芯片验证发现胃癌组织中CRKL蛋白过表达，推测为胃癌组织增殖有关。

2基因芯片在胃癌药物研发中的应用

基因芯片在胃癌研究的作用不仅包括基因筛查，更多表现在预测靶向药物治疗方面。关于胃癌生物靶标治疗是目前研究重点，Takei等[13]分析转移相关的microRNA的miR-516A-3P治疗胃癌可能性，以往研究中微小RNA表达在不同癌症组织中均有异常，在研究中建立小鼠模型，模拟人胃癌腹膜细胞，从HSC-44PE细胞培养高转移性衍生物细胞，采用基因芯片确定异常表达44As3和HSC-44PE细胞miRNA表达，定量分析miR-516A-3P监督表达，从乙酰肝素硫酸除去6-O-硫酸酯蛋白多糖表面，引起膜受体与配体结合，Westem印迹分析显示44As3MIR416A-3P细胞增多，最终发现转移相关性基因可以作为胃癌覆膜上治疗新靶点。Cheong等[14]培养胃癌细胞株，提出RNA，采用基因芯片级型杂交分析，并采用qRT-PCR进行验证，研究发现galectin-3参与细胞侵袭以及对化疗药物的抵抗过程，并通过调节细胞凋亡以及生存基因进行实现，认为化疗中可以通过抑制galectin-3表达离开提高治疗效果。Claerhout等[15]采用基因芯片技术，建立人类胃癌基因特征信号，并指出胃癌治疗中HDAC可以作为重要候选要素，证实基因芯片技术在胃癌研究领域的重要性。

国内对于基因芯片在胃癌药物研究不多，集中在效果证实方面。吴智群等[16]分析曲古抑菌素A诱导胃癌细胞周期阻滞及发生机制，采用胃癌细胞系SGC-7901为研究对象，注射曲古抑菌素A，观察生长情况，取对数生长期细胞染色，采用流式细胞仪分析周期细胞，采用Western检测P53、P21蛋白表达情况，采用基因芯片技术检测不同处理方式胃癌基因表达差异，研究结果指出TSD诱导胃癌细胞周期组织，能够增加胃癌细胞SGC-7901到p53等基因的表达，并降低CK2、CCND1基因表达。中药成分复杂，作用靶点多，防病机制阐述不明确，基因芯片技术的使用为作用机制研究提供可能。许庆瑞等[17]分析复方青龙衣胶囊对胃癌细胞作用机制，设定不同药物浓度梯度，预处理24 h，采用MTT法进行测定，不同浓度药物处理，采用全基因芯片研究胃癌基因表达情况，研究发现不同浓度复方青龙衣胶囊作用胃癌细胞效果不同，与浓度持续正相关，胃癌细胞SGC-7901的半数抑制浓度为1.27×10-3g/L，从对照细胞中筛选出78个差异表达基因，其中23个基因上调，55个基因下调，SGC7901细胞有71条生物信号通路异常，其中15条有下降趋势，23条出现上升趋势，信号通路基因同时存在上升和下降趋势，影响信号通路设计到细胞增殖、细胞周期以及细胞凋亡等方面，认为复方青龙衣胶囊能够影响细胞周期信号通路，抑制肿瘤细胞分裂、增殖和分化引起细胞凋亡。敖慧等[18]分析参术胶囊治疗胃癌基因表达谱变化，将BALB/c-nu/nu小鼠采用食醋法建立动物模型，采用基因芯片检测胃癌转移小鼠和胃癌细胞株，并设置空白对照组，研究发现胃癌转移小鼠以及胃癌细胞株基因异常表达共95条，其中56条基因上调，如CD9、墨角藻糖基转移酶8、谷酰胺肽S-转移酶等，39条下调。上调基因中20条与代谢有关，1条受体类基因，2条蛋白合成基因，1条离子通道和运输类蛋白基因，3条与免疫有关，7条与发育有关，3条与细胞周期有关，4条未知。下调基因表达中，12条与代谢有关，1条与免疫有关，4条与细胞周期有关，2条与DNA复制有关，1条与细胞凋亡有关，3条与离子通道和运输类有关，8条未知，模型Ttr出现上调减少，表明参术胶囊能够使Ttr下调，达到治疗效果。

3基因芯片在胃癌预后分析标志物中的应用

肿瘤标志物是近几年的研究热点，人体内含有多种物质提示肿瘤预后的信息，早期对这类因素进行检测，对肿瘤早期诊断和治疗有现实意义。

国内外利用基因芯片研究基因在胃癌表达情况有很多，miR-191是近些年研究热点之一。郭鹏辉等[19]分析miR-191在胃癌组织中的表达，采用SYBR Green I实时荧光定量PCR技术检测胃癌组织和胃癌旁正常组织miR-191表达情况，并利用生物学信息软件进行靶基因预测，分析与MiR-191表达情况关系，结果发现胃癌组织中mIR-191表达异常升高，miR-191预测靶基因包括SOX4以及NDST1等。国外学者利用微阵列结合其他技术指出胃癌发生中MTMR3发挥重要作用[20]，采用不同胃癌患者组织进行研究发现miRNA能够准确区分292例样品，发现不同类型胃癌患者基因表达存在异常，弥漫性胃癌患者8个特异性miRNA上调，肠型胃癌则有4个基因上调，并指出miR-214高表达患者预后差。Matsuo等[21]利用基因芯片技术对采取手术治疗患者进行基因表达研究，发现胃癌组织中miR-29c表达较低，认为RCC2基因表达下降引起肿瘤细胞增殖。

4结语

基因芯片在胃癌研究领域中发挥重要作用，随着芯片中包含的基因数的增长，筛选处的基因不断增多，但是目前基因芯片应用操作难度比较大，成本昂贵，而且没有形成统一规定标准，容易造成资源的浪费。应用研究中还无法采取定量检验，需要配合PCR等技术手段，而且联合使用中扩增模板存在局限性，影响信号检测的灵敏度和特异性。虽然基因芯片在应用中还存在很多缺点，但是不能否认在胃癌基因表达谱测定中的作用，未来研究中还需要与其他技术结合在一起，扩大基因芯片分析范围，同时还需提高灵敏度，降低研究成本。

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[收稿日期]2015-11-30

[中图分类号]R735.2

[文献标识码]A

[文章编号]1008-8849(2016)12-1363-03

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.12.040