口蹄疫诊断技术的研究进展

特尼格尔，黄天鹏

（内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古 呼和浩特 010018）

口蹄疫诊断技术的研究进展

特尼格尔，黄天鹏

（内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古 呼和浩特 010018）

口蹄疫的准确诊断是有效控制疫情蔓延的重要环节。随着生物学技术的迅速发展，口蹄疫的诊断已经不再局限于传统方法。目前，常用的口蹄疫诊断方法包括血清学检测、分子生物学诊断和病原学诊断，其中以血清学检测的应用最为广泛。阐述了3种诊断方法的原理及优缺点，并展望了口蹄疫诊断技术未来的发展方向。

口蹄疫；血清学检测；分子生物学诊断；病原学诊断

口蹄疫（foot-and-mouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒 （foot-and-mouth disease virus，FMDV）感染而引起的偶蹄动物（猪、牛、羊、骆驼、鹿等）最重要的传染病之一［1］。其主要特征表现为患病家畜的无毛或者少毛部位，如乳房、蹄及口腔黏膜出现水泡和溃烂，人们往往基于这些特征对该病进行初步的诊断。然而，有时仅通过其临床表现又难以与其他水泡性疾病，如水泡性口炎（vesicular stomatitis，VS）和猪水泡病（swine vesicular disease，SVD）等进行鉴别诊断，因此，必须利用更加有效的方法进行准确诊断，如实验室诊断方法［2］。目前，国内外已经建立了多种FMD的实验室诊断方法，主要包括血清学检测、分子生物学诊断和病原学诊断3大类，这3大类方法的建立为FMD的科学诊断及有效预防提供了有力的技术保障。

1 血清学检测

血清学检测是指从动物机体分离出FMDV后，将分离的FMDV作为抗原，与患病动物的血清发生凝集反应的试验，主要包括免疫扩散试验、补体结合试验、病毒中和试验、凝集试验、酶联免疫吸附试验等。

1.1 免疫扩散试验 （agar gel immunodiffusion，AGID） 应用AGID技术不仅可以检测FMDV抗原，而且还可以检测FMDV抗体。其原理是当FMDV与相应的抗体结合后，在某些电解质参与的条件下经过一定时间的反应，出现肉眼可见的明显的白色沉淀线，并能在48 h之内观察到试验结果。AGID技术的主要用途有鉴定FMDV抗原的纯度、检测FMDV抗体的效价等，其操作步骤简便、快捷，但其敏感性较低。

1.2 补体结合试验 （complement fixation test，CFT） 自Brooksby在1952年发明了CFT技术以来，人们对该种方法的应用已有半个多世纪的历史。其工作原理是当FMDV抗原与相应的抗体反应形成抗原—抗体复合物后，该复合物能够结合补体，在致敏红细胞（溶血素）的作用下会引起红细胞肿胀，进而出现溶血现象，因此，人们往往通过是否出现溶血反应来判定家畜是否感染FMDV［3］。该方法主要有如下优点：应用范围广、试验结果显而易见、对试验条件的要求低等。然而该方法也存在着一些缺陷，如敏感性低、操作步骤繁琐、反应过程易受到外界因素的干扰等［4］。

1.3 病毒中和试验 （virus neutralization test，VNT） VNT技术的原理为：FMDV与相应的抗体结合后，使抗原失去吸附细胞的能力，从而失去了对易感动物的侵袭力。其操作方法是：用不同比例稀释的FMDV阳性血清与FMDV均匀混合，在室温条件下放置一段时间后接种细胞管。通过仔细地观察细胞病变，以能保护半数细胞管中的细胞不被FMDV吞噬的血清稀释比例为终点。中和抗体的特异性高，且在动物机体内能够维持很长一段时间，但需要培养单层细胞。目前，VNT技术对FMDV检测的用途比较广泛，主要有FMDV分离株的鉴定、FMDV疫苗免疫原性的研究、免疫血清的质量评价、检测实验动物血清是否含有FMDV抗体等。

1.4 间接红细胞凝集试验（indirect hemagglutination assay，IHA） 该技术由 Hirst等在 1941年发明，利用IHA技术可以对FMDV进行定性和定量检测。将FMDV抗原用化学方法吸附在绵羊红细胞载体上，形成致敏红细胞，当致敏红细胞在电解质的环境下与被检相应抗体相遇时，会与其特异性抗体结合，发生肉眼可见的凝集反应［5］。IHA技术包括2种，即正向与反向，分别用来检测血清中的抗体及抗原水平。由于该反应是通过抗原抗体特异性反应而间接地带动红细胞的凝集，因此被称为间接红细胞凝集试验。该方法的优点是易于判定结果、操作步骤较为简单且经济实用，但有时不能辨别FMDV 自然感染及免疫接种［6］。

1.5 酶联免疫吸附试验 （enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA） ELISA技术首次报道于1971年，是由Engvall和Perlman建立的。ELISA技术是目前应用最为广泛、发展最快的免疫学技术之一，其广泛应用于不同病原生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等疾病的诊断。其基本原理是将特异性的抗体包被于聚苯乙烯微量反应板，加入待检抗原，经过37℃温育与数次的洗涤后加入用特异性酶标记的抗体，再经过孵育，洗涤除去游离的成分，最后用底物显色。ELISA方法具有高灵敏度、高特异性、室温下稳定、操作方便、应用范围极为广泛等优点［7］。笔者主要介绍以下4种常用于检测FMDV的ELISA方法。

1.5.1 液相阻断ELISA （liquid phase blocking ELISA）：液相阻断ELISA用于检测FMDV衣壳蛋白的抗体，进而评估动物的免疫状态［8］。其用途主要有2种：第1种是检查待检动物被FMDV感染的情况，目前被国际贸易机构广泛应用；第2种是检测免疫抗体，评估FMDV疫苗免疫动物抵抗病毒的能力［9］。1987 年，Hamblin 等创建了用于检测 FMDV的液相阻断ELISA方法，后经试验证明该方法具有敏感性高、结果准确、操作便捷等优点，在普通实验室条件下可以完成操作，因此在2004年该方法被OIE认可为标准化的FMD诊断技术［10］。该方法的缺点是假阳性结果的出现率较高，有时必须进一步通过VNT技术来对试验结果进行验证［6］。

1.5.2 间接夹心 ELISA（indirect sandwich ELISA）：间接夹心ELISA是利用FMDV抗体直接检测FMDV，主要用途是鉴定FMDV的血清型，确定FMDV毒株与流行毒株的抗原谱关系。间接夹心ELISA的灵敏度相比于其他的ELISA方法更好，且检测结果与病毒分离和电镜检测方法有着很高的符合率［11-13］。有研究报道，应用该种方法进行病毒抗原检测时，其检测的灵敏度甚至超过了电镜负染检测方法［14］。利用该方法检测FMDV的缺点是对试验条件的要求较高，因此只能在专业实验室中进行［6］。

1.5.3 间接 ELISA （indirect ELISA）：各类检测FMDV的血清学方法当中，间接ELISA是目前应用最为广泛的技术之一，其能够对FMDV感染进行准确的诊断［15］。间接ELISA是通过FMDV的非结构蛋白区域（如2C、3AB及3ABC）来辨别自然FMDV感染动物与免疫动物的抗体［16］。用不同种抗原包被固相载体后，只需一种酶标记的二抗就可以鉴定多种抗体，因此，该方法在实践中被广泛应用于各种病原生物抗体的检测。但其操作过程较为繁琐且极易受到外界条件的干扰而产生假阳性结果。

1.5.4 固相竞争ELISA （solid phase competitive ELISA）：固相竞争ELISA的原理是以灭活的全病毒140S作为抗原，检测FMDV抗体［17］。固相竞争ELISA方法不仅延续了液相阻断ELISA的优点，且其特异性超过99.5%，敏感性可达100%，因此更适用于大批血清的检测［18］。由于该技术具有以上优点，其在2004年被OIE指定为FMDV血清学检测方法。林密等［19］利用固相竞争ELISA的方法对不同性质的血清进行检测，结果表明，A型及AsiaⅠ型疫苗株阳性血清并未出现阳性结果以及交叉反应，证明了该方法的高度特异性。但固相竞争ELISA的洗涤过程比较多，有时可能会影响样品检测的速度，因此不适合快速地检测大量样品。

2 分子生物学诊断

FMDV的分子生物学诊断技术是通过各种分子生物学的方法来检测待检样品是否含有FMDV的核酸序列，其应用非常广泛，可直接在牧场进行检测并辅助完成病情的初步诊断。分子生物学技术具有很高的灵敏度，且能够同时检测多种样品。分子生物学技术包括实时荧光PCR、核酸杂交、基因芯片、核酸杂交、等电点聚焦电泳、多重PCR等。

2.1 实时荧光PCR（real time RT-PCR） 实时荧光PCR主要应用于FMDV的快速检测，是目前国内标准的FMDV检测方法之一。实时荧光PCR技术诞生于20世纪90年代末，该技术利用荧光染料或荧光标记的特异性探针来跟踪PCR扩增产物的荧光信号，从而定性或定量地分析初始模板中的FMDV及其含量［20］。实时荧光PCR反应在带有透明盖的单个塑料小管中进行，有效地减少了样品之间交叉污染的机会，因此适用于FMD暴发后大规模样品的检测［21］。李永东等［22］通过TaqMan技术优化了利用RT-PCR检测FMDV的方法，建立的方法对FMDV的检测下限为0.01TCID50，具有超高的敏感性。

由于实时荧光PCR不仅能够检测出FMDV，还能鉴定FMDV的血清型 （至少能够鉴定出6种FMDV的血清型），其特异性很强，且在1 h之内能够得到结果，因此，目前该技术的应用主要集中在FMD的快速诊断［10］。缺点是其相关的试剂很昂贵，需要提取基因组RNA，且有时会出现假阳性结果，因此只能在专业实验室的条件下才能对FMD进行诊断。

2.2 基因芯片技术 尽管实时荧光PCR方法具有很强的特异性，但单次检测FMDV基因的样品数量很有限。当FMD暴发时，有必要通过一种方法来同时检测大量靶基因的表达，迅速准确地在基因组水平上阐述FMDV基因转录本的变化规律。为了满足这些需求，基因芯片技术随之诞生。

基因芯片是利用机械臂把FMDV基因片段点在玻璃片上，再经过物理吸附作用达到固定化（cDNA芯片）。利用已知的FMDV核苷酸序列作为探针，与大量的靶核苷酸序列进行杂交，以检测众多基因的表达调控情况。在短短的几十年内，基因芯片技术就得到了蓬勃的发展，这是由于其能够快速、准确、自动化、高通量地检测靶基因［23］。然而有些相关问题仍然有待解决：样本制备成本很高，操作复杂；灵敏度较低，标记没有统一标准；要求实验员能够熟练地掌握设备的操作等［24］。

2.3 核苷酸序列分析 核苷酸序列分析法结合了荧光定量PCR与核酸序列测定技术，通过对样品进行序列分析后与数据库中已知的序列进行比较，寻找FMDV目的基因功能位点的位置。科研人员运用该方法能够判断毒株的序列是否与已报道的FMDV序列存在同源性，并能够绘制毒株的遗传系统进化树［25］。目前，核苷酸序列分析技术主要应用于FMDV的遗传变异、比较不同毒株核酸序列的同源性及疫源追踪研究［21］。

3 病原学诊断

应用生物学技术检测FMDV也是一种比较实用的方法，其原理是利用FMDV上清接种动物使得动物细胞产生病变，再从动物体内分离出FMDV，从而证实FMDV的存在。FMDV可以在多种动物细胞中增殖，但对不同细胞的敏感性也不尽相同。例如，FMDV对初代小牛甲状腺（CTY）细胞的敏感性极高，其次是幼仓鼠肾细胞系BHK-21等［26］。因此，通常利用初代小牛甲状腺细胞与幼仓鼠肾细胞系等敏感细胞系进行FMDV分离试验。其结果是以动物细胞是否发生病变为根据：如果接种FMDV上清48 h内产生了细胞病变，则判定为阳性；如果接种FMDV上清48 h后细胞依然未发生病变，则对细胞进行连续传代再观察细胞是否病变，如果仍没有细胞病变，则判定为阴性。病原学诊断的优点为结果准确、可靠，但灵敏度较低，且耗时、耗力。

4 展望

FMD是世界范围内严重影响畜牧业健康发展的恶性传染病，一旦暴发后会对畜牧产业造成毁灭性的灾难［27-28］。因此，尽早诊断FMD并有效地实施患病动物的隔离是非常关键的。通过上述阐述不难发现，各种FMDV检测方法均有各自的优缺点，实际检测时应基于批量检测工作的需要来选择最合适的方法。目前，对FMDV检测技术的研究集中在ELISA试剂盒的研发、应用免疫胶体金技术来进行定量检测、实时荧光定量PCR及检测活畜IgA、IgM的pen-side法等领域［6］。近年来，随着对FMDV的深入研究，FMD的诊断技术也在日益成熟，很多科研人员正在试图将多种FMDV检测方法结合起来取长补短，进一步完善其应用价值。

总之，未来的FMDV检测方法的研究热点会集中在血清学与分子生物学技术领域。高效、快速、便于操作并适合基层应用的方法必将成为FMD诊断技术的发展趋势。

［1］特尼格尔.多型FMDV VP1表位嵌入型S-层蛋白SLP-Multi VP1的纯化及其免疫原性试验［D］.呼和浩特：内蒙古农业大学，2015.

［2］郑海学，何继军，郭建宏，等.口蹄疫及其防控技术［J］.兽医导刊，2012（12）：35-38.

［3］朱文钏，孔繁德，林祥梅，等.口蹄疫检测技术的研究进展与应用［J］.经济动物学报，2009（3）：171-177.

［4］颜思通，林志雄，朱道中，等.微量补体结合试验检测牛、羊副结核病的研究［J］.中国动物检疫，2004（11）：23-26.

［5］马军武.口蹄疫的诊断技术［J］.兽医导刊，2009（6）：28-30.

［6］武刚，王洪梅，刘晓，等.口蹄疫诊断技术研究进展［J］.家畜生态学报，2011，32（2）：100-105.

［7］厍大亮，李冬.酶联免疫吸附试验在口蹄疫诊断中的研究进展［J］.中国农学通报，2011，27（29）：27-32.

［8］赵鑫，杨军旗，邹迎梅，等.液相阻断ELISA在奶牛A型口蹄疫抗体水平检测中的应用［J］.北京农业，2010（8）：6-8.

［9］吉文献，沈之中，张太林，等.口蹄疫液相阻断ELISA试验操作中几个关键点［J］.黑龙江畜牧兽医，2011（4）：67.

［10］王莉娟，徐天刚，赵云玲，等.口蹄疫诊断技术研究进展［J］.中国畜牧兽医，2005，32（3）：41-44.

［11］杜念兴.兽医免疫学［M］.上海：上海科学技术出版社，1985：218-223.

［12］金田由美，陈奖励.ELISA在禽病诊断中的应用［J］.国外兽医学：畜禽传染病，1990，10（4）：51-53.

［13］NICHOLA.ELISA在检测禽病毒病抗体上的应用［J］.国外兽医学：畜禽传染病，1987，7（2）：11-12.

［14］范泉水，齐桂凤，王度林，等.应用ELISA双抗体夹心法诊断鸭冠状病毒性肠炎的研究［J］.中国畜禽传染病，1996（5）：41-44.

［15］黄红亮，周锐，陈美玲，等.胸膜肺炎放线杆菌毒素apxIVA基因的克隆与表达及间接ELISA方法的建立［J］.生物工程学报，2005，21（2）：294-299.

［16］范翠翠.O型口蹄疫病毒VP1重组蛋白的表达及其免疫原性的研究［D］.扬州：扬州大学，2008.

［17］MACKAY D K，BULUT A N，RENDLE T，et al.A solidphase-competition ELISA for measuring antibody to footand-mouth disease virus ［J］.J Virol Methods，2001，97（1/2）：33-48.

［18］CHÉNARD G，MIEDEMA K，MOONEN P，et al.A solidphase-blocking ELISA for detection of type O foot-andmouth disease virus suitable for mass serology ［J］.J Virol Methods，2003，107（1）：89-98.

［19］林密，马军武，祁淑芸，等.O型口蹄疫病毒固相竞争ELISA抗体检测方法的建立［J］.中国预防兽医学报，2008，30（8）：627-630.

［20］董恩妮，梁青，李利，等.实时荧光定量PCR内参基因的选择［J］.中国畜牧杂志，2013（11）：92-96.

［21］魏婕.AsiaⅠ型FMDV VP1蛋白原核表达及条件优化［D］.乌鲁木齐：新疆农业大学，2009.

［22］李永东，张常印，姜平，等.口蹄疫病毒实时RT-PCR检测方法的建立 ［J］.中国人兽共患病学报，2006，22（3）：212-215.

［23］阮力.检测口蹄疫病毒基因芯片技术与3B-ELISA鉴别诊断方法研究［D］.武汉：华中农业大学，2005.

［24］孙芳芳，董英，薛强，等.口蹄疫病毒分子生物学检测方法研究进展［J］.中国畜牧兽医，2013，40（6）：190-194.

［25］肖啸，杨继生，张静，等.口蹄疫诊断技术的研究进展［J］.中国畜牧兽医，2008，35（2）：78-81.

［26］HAMBLIN C，BARNETT I T，CROWTHER J R，et al.A new enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）for the detection of antibodies against foot-and-mouth disease virus.Ⅱ.Application［J］.J Immunol Method，1986，93（1）：123-129.

［27］HAMBLIN C，KITCHING R P，DONALDSON A I，et al.A new enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA） for the detection of antibodies against foot-and-mouth virus.Ⅲ.Evaluation of antibodies after infection and vaccination［J］.Epidemiol Infect，1987，99（3）：733-744.

［28］李刚.FMDV结构基因的克隆与序列分析和VP1的表达及间接ELISA方法的建立［D］.哈尔滨：东北农业大学，2006.

Research Progress on Diagnostic Techniques of Foot-and-mouth Disease

Tenigeer，HUANG Tian-peng
（College of Veterinary Medicine，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot010018，China）

The accurate diagnosis of foot-and-mouth disease is essential to control the spread of the disease.With the rapid development of biotechnology,the diagnosis of foot-and-mouth disease is no longer restricted to traditional methods.At present,the commonly used methods are including serological detection which has the widest application range,molecular biological diagnosis and etiological diagnosis.In this paper,a review is given on the principle as well as advantages and disadvantages of the 3 above-mentioned diagnostic techniques,and the future development of foot-and-mouth disease diagnostic techniques is prospected.

foot-and-mouth disease；serological detection；molecular biological diagnosis；etiological diagnosis

S854.4；S855.3

A文章顺序编号1672-5190（2016）03-0102-04

2016－03－05

特尼格尔（1990—），男，硕士，主要研究方向为兽医微生物与免疫学。

（责任编辑：赵俊利）