抗菌肽JH-3的抑菌活性及其稳定性分析

魏晓晓，杭柏林，马　翠，夏一赫，张冰清，王　青，徐彦召，胡建和

(河南科技学院动物科学学院，新乡 453003)



抗菌肽JH-3的抑菌活性及其稳定性分析

魏晓晓，杭柏林*，马翠，夏一赫，张冰清，王青，徐彦召，胡建和*

(河南科技学院动物科学学院，新乡 453003)

摘要：对牛血红蛋白源抗菌肽P3进行氨基酸改造，并了解改造后抗菌肽JH-3的抑菌活性和稳定性。通过微量稀释法检测了抗菌肽JH-3的最小抑菌浓度(MIC)，通过扫描电镜观察了细菌和真菌形态的变化，测定了抗菌肽JH-3的溶血性、热稳定性、酸碱稳定性和盐稳定性。结果表明：抗菌肽JH-3对革兰阳性菌(金黄色葡萄球菌、猪链球菌2型)的MIC为6.25～25 μg·mL-1，对革兰阴性菌(大肠杆菌、猪霍乱沙门菌、副猪嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌)的MIC为3.125～50 μg·mL-1，对真菌(白色念珠菌)的MIC为12.5 μg·mL-1，均具有良好的抗菌活性。经抗菌肽JH-3处理后，大肠杆菌细胞表面出现皱缩、孔洞；金黄色葡萄球菌出现菌体皱缩，细胞的完整性受到破坏；白色念珠菌细胞表面出现凹陷、突出、裂痕。在 6～100倍MIC时312.5 μg·mL-1抗菌肽JH-3的溶血率仅12.84%；75～100 ℃的高温、80～100 mmol·L-1的高浓度NaCl和pH 4.0及pH 10.0的高酸碱性对抗菌肽JH-3的抑菌活性没有明显的影响。研究结果为抗菌肽JH-3的临床应用提供了理论基础，且抗菌肽JH-3有替代抗生素成为新抗菌药物的潜力。

关键词：抗菌肽JH-3；抑菌活性；溶血性；稳定性

自弗莱明发现青霉素后，抗生素对人类的贡献居功甚伟。但是，随着抗生素的广泛应用，一些负面问题日益突出。抗生素的大量使用和滥用导致了耐药性菌株的不断出现，如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)[1]和耐万古霉素肠球菌(VER)[2]等，使得临床疾病的治疗愈发困难。同时药物残留对人类的健康威胁也愈发严重[3]。有效且安全的新抗生素研发成功往往滞后于耐药性菌株的出现。许多国家已禁止在动物饲料中应用抗生素[4-5]。因此，选择抗生素替代物成为必然选择。抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)是机体先天免疫系统的重要组成部分[6]，参与机体的第一道防线，具有抗菌、抗病毒、抗寄生虫、抗肿瘤和免疫调节等活性[7-8]。与抗生素相比，抗菌肽的抗菌机制独特、不易诱发耐药性、安全度较高[9-10]，因此，抗菌肽是抗生素的理想替代品[11]。

目前，通过不同方法获得的抗菌肽已达2 500多种[12]。但是，许多抗菌肽存在抑菌活性不强、溶血性、细胞毒性等缺点。因此，提高抗菌肽抑菌活性、降低其对机体毒性是现在研究的热点。P3是一株牛红细胞血红蛋白源抗菌肽，具有一定的抗菌活性[13-14]。但是，人工合成P3的抗菌活性低。对已有抗菌肽的氨基酸序列进行改造是提高抗菌肽抗菌活性的一条有效途径。因此，本研究对P3的氨基酸进行了分析，设计了一条P3类似多肽JH-3，通过MIC测定、SEM(扫描电镜观察)对JH-3的抑菌活性及其稳定性和溶血性等进行了综合分析，以期为JH-3的进一步开发提供科学的依据。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1抗菌肽抗菌肽JH-3由上海吉尔生化有限公司采用固相法合成，电喷射质谱鉴定，反相高效液相色谱纯化，纯度>97%。1.1.2试验菌株和试剂大肠杆菌(ATCC25922)、金黄色葡萄球菌(ATCC29213)、白色念珠菌(ATCC90029)等菌株均购自ATCC，沙门菌(CVCC503)、链球菌2型(CVCC606)、副猪嗜血杆菌(CVCC3728)、胸膜肺炎放线杆菌(CVCC268)等菌株均购自CVCC。TSB(Tryptic Soy Broth，Solarbio公司)，胎牛血清(Gibco公司)，氨苄青霉素(Solarbio公司)，制霉菌素(Solarbio公司)，胰蛋白胨(Oxoid公司)，酵母提取物(Oxoid公司)。其他试剂为国产分析纯。1.1.3实验器材打孔器(Ø为3 mm，北京普波斯生物有限公司)，高压灭菌锅(日本Hirayama公司)，生物安全柜(美国Thermo Scientific公司)，37 ℃培养箱(上海一恒科技有限公司)，高速离心机(美国Thermo Scientific公司)，多功能酶标仪(美国Thermo Scientific公司)，数显恒温水浴锅(金坛市杰瑞尔电器有限公司)，扫描电子显微镜(美国FEI公司)。

1.2试验方法

1.2.1理化特性的预测通过抗菌肽数据库APD(http：//aps.unmc.edu/AP/main.php)对JH-3和P3的氨基酸序列进行理化特性预测。进入网站后选择“Calculation & Prediction”，在方框中输入抗菌肽序列，点击“submit”，会得到相对分子质量、总电荷数和疏水率等数据。

1.2.2抑菌活性的测定根据微量稀释法[15]测定抗菌肽抑菌活性。挑取细菌分别接种于TSB培养基(pH 7.2)或含5%胎牛血清的LB培养基(胰蛋白胨10 g·L-1，酵母提取物5 g·L-1，NaCl 5 g·L-1，pH 7.2)中，37 ℃培养12 h。再进行新鲜培养3 h，于4 ℃、4 000 r·min-1的条件下离心10 min，弃去上清，用PBS悬浮细菌，离心，弃上清，再用磷酸缓冲液(PBS，pH 7.4)悬浮细菌，调整细菌浓度为1.0×106CFU·mL-1，取50 μL加入96孔板中，然后分别加入用灭菌水稀释的200、100、50、25、12.5、6.25和3.125 μg·mL-1的抗菌肽50 μL，37 ℃作用24 h，肉眼观察菌液澄清度，菌液浑浊表明有菌生长，浑浊和澄清分界处的抗菌肽浓度即为MIC。每个稀释度3个重复。

1.2.3电镜观察分别调整对数生长期大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌的浓度为1.0×106CFU·mL-1，以加入MIC浓度的抗菌肽为试验组，以不加抗菌肽的菌液为对照组；37 ℃作用30 min；然后按照扫描电镜样品制备方法进行处理菌液，送新乡医学院电镜实验室观察菌体形态变化。

1.2.4溶血性的测定按照文献[16]进行溶血性的测定。通过耳缘静脉以无菌操作采集新西兰兔血液，用肝素进行抗凝。抗凝血经1 000×g离心5 min，弃去上清液，沉淀经磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，再用PBS稀释，并调整红细胞浓度为1%(体积百分数)。稀释抗菌肽，使其浓度分别为312.5、31.25和3.125 μg·mL-1，然后等体积加入红细胞悬液，以PBS为阴性对照，1%(体积百分数)Tritonx-100为阳性对照，37 ℃作用1 h，1 000×g离心5 min，取上清液，依次加入96孔板中，用酶标仪测定OD值(波长540 nm)，根据OD值来计算溶血率。溶血率(%)=(试验组OD值-阴性对照OD值)/(阳性对照OD值-阴性对照OD值)×100%。

1.2.5稳定性分析以大肠杆菌为试验菌株，通过琼脂糖平板扩散法[7]检测抗菌肽的活性。将1 mg·mL-1的抗菌肽JH-3分别放在0、25、50、75和100 ℃中处理30 min，以检测抗菌肽的热稳定性。用浓度为250、200、150、100和50 mmol·L-1的NaCl溶液稀释抗菌肽，使抗菌肽浓度为1 mg·mL-1，作用30 min，以检测抗菌肽的盐稳定性。用1 mol·L-1的HCl和NaOH调整LB培养基的pH分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0，以检测抗菌肽的酸碱稳定性。

2结果

2.1设计抗菌肽JH-3理化特性

将正电荷引入抗菌肽序列，可以影响抗菌肽与细菌细胞膜的结合效率，可提高杀菌活性。抗菌肽JH-3是将牛血红蛋白源抗菌肽P3的第一位缬氨酸(V)和第二位天冬氨酸(N)都替换为精氨酸(R)后设计并合成的类似物多肽，其分子式为RRFKLLSHSLLVTLASHL。从表1中可以看出，抗菌肽JH-3的静电荷比原抗菌肽P3增加了2个净电荷数。

2.2抑菌活性检测

2.2.1抗菌肽JH-3的抑菌活性从表2可以看出，JH-3的抑菌活性比原抗菌肽P3的高。JH-3对革兰阴性菌、革兰阳性菌和真菌的抑菌活性略有不同，对测定的革兰阴性菌的MIC为3.125～50 μg·mL-1，对革兰阳性菌的MIC为6.25～25 μg·mL-1，对真菌的MIC为12.5 μg·mL-1，表明抗菌肽JH-3具有广谱的抗菌活性。

表1设计肽JH-3的理化性质

Table 1Properties of design peptide JH-3

表2抗菌肽JH-3 MIC的测定

Table 2 Determination MIC of antimicrobial peptide JH-3

ND.No detection

2.2.2电镜观察从图1的扫描电镜可以看出，经过MIC浓度的抗菌肽处理30 min后，大肠杆菌菌体已经发生了明显的变化，菌体细胞表面凹凸不平，某些细菌断裂，表面出现孔洞性开口，导致细菌内含物泄漏(图1D)；金黄色葡萄球菌形态发生变化，菌体皱缩，细胞的完整性受到破坏(图1E)；白色念珠菌细胞膜表面出现凹陷、突出、裂痕(图1F)。这表明，抗菌肽JH-3严重破坏了革兰阴性菌、革兰阳性菌和真菌细胞的完整性。

2.3溶血活性测定

如图2所示，在312.5 μg·mL-1时，抗菌肽JH-3的溶血率为12.84%，远远低于50%，而这一浓度超过抗菌肽MIC的6～100倍。这表明，抗菌肽JH-3对红细胞的渗透脆性影响很小，有较高的安全性。

2.4稳定性分析

一些外界因素会影响抗菌肽的抑菌活性，如温度、离子强度、酸碱性等。由图3A可知，1 mg·mL-1的抗菌肽JH-3经不同温度处理30 min，抑菌活性随着温度增加而有所减弱，但是在100°C处理30 min后，JH-3抗菌肽仍具有抑菌活性。这表明，抗菌肽JH-3具有一定的热稳定性。由图3B 可知，JH-3抗菌肽在小于或大于0.9%(154 mmol·L-1)NaCl盐溶液中，其抑菌活性仅轻微减弱，这表明，离子浓度对抗菌肽JH-3的抑菌活性没有显著影响。由图3C可知，在pH为7时，抗菌肽JH-3的抑菌活性最高，而在pH 4～7和pH 7～10时，抗菌肽JH-3仍有抑菌活性。这表明抗菌肽JH-3可以在较宽的pH范围内发挥抑菌活性。

3讨论

近年来，由于传统抗生素不合理使用所造成的细菌耐药、药物残留问题日渐突出，且对人类的健康造成了极大的威胁[17-18]。在寻找传统抗生素替代品的过程中，抗菌肽以其分布广、不易产生耐药性、不易产生药物残留的优点而受到广泛关注[6，19]，但是在实际应用过程中，某些天然抗菌肽存在抗菌活性不高、会对宿主细胞产生一定的毒性和溶血性等缺陷[6，16，19]，这在一定程度上阻碍了抗菌肽的临床应用。因此，寻找高效抗菌活性的抗菌肽成为必然趋势。

目前，一般认为抗菌肽的电荷量和疏水性会影响其抗菌活性[20]。因此，在抗菌肽的研究过程中，通常采用改变其多肽链电荷量或疏水性的方式对天然抗菌肽进行分子改造，以获得具有良好抑菌活性、

且细胞毒性较小的抗菌肽类似物。A.P.Subasinghage等[21]以赖氨酸(K)替代抗菌肽XT-7序列中的甘氨酸(G)降低其溶血性，而且还增加了对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的杀菌能力。H.S.Ahn等[22]将昆虫防御素片段Tenecinl中的三个氨基酸突变为强碱性的色氨酸(W)和赖氨酸(K)，使无活性的片段具备了抗真菌和抗细菌活性，且溶血性并无增加。JH-3是通过对牛红细胞血红蛋白源抗菌肽P3的氨基酸序列进行分子改造设计的类似物，以精氨酸(R)分别替代P3序列N段的缬氨酸(V)、天冬氨酸(N)，有效提高了正电荷量。抑菌试验结果表明，改造后的JH-3对细菌和真菌的杀菌作用有明显的提高，且溶血率较低，对盐、热和酸碱的稳定性较好。下一步，将通过色氨酸或赖氨酸等替换P3或JH-3中的部分氨基酸，进行抗菌活性及溶血率和稳定性等方面的检测，以期找到更好的有价值的抗菌肽。

目前，关于抗菌肽的作用机制尚无统一的理论体系。但是，大多数人认为作用于细菌细胞膜是抗菌肽发挥抗菌活性的关键[19]。本试验通过电镜观察发现，抗菌肽JH-3处理后的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌出现不同程度的受损，如细胞表面出现皱缩、孔洞样结构、凹陷、突出、裂痕等，表明抗菌肽JH-3作用于细菌后，破坏了细胞膜的完整性。

抗菌肽抗菌活性的稳定性会受到许多因素的影响，如温度、酸碱性、离子浓度等[23]。温度过高会逐渐降低抗菌肽的抗菌活性。吴琼英等[24]研究乳源抗菌肽抑菌活性时，发现抗菌肽对金黄色葡萄球菌的抑制活性随着温度的升高逐渐减弱。pH可以影响抗菌肽的抗菌能力。S.G.Dashper等[25]发现抗菌肽kappacin的抗菌活性在酸性环境下才具有活性，认为pH影响抗菌肽与细胞膜的结合。离子导致的电荷变化会使抗菌活性降低。大多数β-防御素在150 mmol·L-1氯化钠浓度下会丧失生物活性[26]。本试验对抗菌肽JH-3耐热性、酸碱稳定性和离子稳定性进行了初步评价，结果表明，抗菌肽JH-3具有较好的耐热性、酸碱稳定性和离子稳定性。这为抗菌肽JH-3今后的实际应用提供了良好的理论基础。

4结论

抗菌肽JH-3具有较好的抗革兰阳性菌、抗革兰阴性菌和抗真菌的活性，使细菌或真菌的细胞表面出现孔洞结构、凹陷、皱缩、裂痕，有较低的溶血率，有较好的耐热性、酸碱稳定性和离子稳定性。抗菌肽JH-3具有代替抗生素在临床上应用的潜力，为开发新型抗菌药物提供了物质基础。

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(编辑白永平)

Analysis of Antimicrobial Activity and Stability of Antibacterial Peptide JH-3

WEI Xiao-xiao，HANG Bo-lin*，MA Cui，XIA Yi-he，ZHANG Bing-qing，WANG Qing，XU Yan-zhao，HU Jian-he*

(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，HenanInstituteofScienceandTechnology，Xinxiang453003，China)

Key words:antibacterial peptide JH-3；antibacterial activity；haemolytic activity；stability

Abstract:The aim of the present study was to modify antimicrobial peptide P3 from bovine hemoglobin on amino acid，and to know the antibacterial activity and stability of the antibacterial peptide JH-3 modified based on P3.The minimum inhibitory concentrations (MIC) of JH-3 against several bacteria were detected with the method of serial dilution.The morphology changes of bacterial and fungus were observed by scanning electron microscope (SEM).The hemolytic activity，thermal stability，acid base stability and salt stability of the antibacterial peptide JH-3 were determined.The results showed that the MIC of JH-3 against gram positive bacteria (Staphylococcusaureus，Streptococcussuis2 type) was between 6.25-25 μg·mL-1.The MIC against Gram negative bacteria (Escherichiacoli，Salmonellacholeraesuis，Haemophilusparasuis，Actinobacilluspleuropneumoniae) was between 3.125-50 μg·mL-1.The MIC against fugus (Moniliaalbicans) was 12.5 μg·mL-1.Shrinkage and holes appeared on the surface of treatedE.colicells.Shrinkage and incomplement presented on the cell surface ofS.Aureus.AndM.albicanshowed sunken，protruding and crack.Hemolytic rate of JH-3 was only 12.84% at 312.5 μg·mL-1(6-100 times MIC).At the condition of 75-100 ℃，80-100 mmol·L-1NaCl，pH 4 and pH 10，the antimicrobial activity of JH-3 was not changed significantly.These findings provided theoretical basis for the clinical application of antimicrobial peptide JH-3，and antibacterial peptide JH-3 has the potential as the new antibacterial drugs instead of antibiotics.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.02.020

收稿日期：2015-07-08

基金项目：国家自然科学基金项目(31372469)；河南省科技计划项目(142300410142)；河南省高校科技创新团队支持计划(15IRTSTHN)；河南科技学院2015年大学生创新训练计划项目(2015CX035)；教育部2015年国家级大学生创新创业训练项目(201510467005)

作者简介：魏晓晓(1990-)，女，河南商丘人，硕士生，主要从事动物病原与新兽药的研究，E-mail：weixiaoxiao926@163.com *通信作者：胡建和，E-mail:hujianhe@hist.edu.cn；杭柏林，E-mail:yzhbl001@126.com

中图分类号：S852.4

文献标志码：A

文章编号:0366-6964(2016)02-0361-06