禽呼肠孤病毒强毒株和弱毒疫苗株感染Vero细胞的蛋白质组学研究

黄　莉，谢芝勋，谢丽基，邓显文，谢志勤，范　晴，罗思思，黄娇玲，曾婷婷，张艳芳，王　盛

(广西壮族自治区兽医研究所 广西畜禽疫苗新技术重点实验室，南宁 530001)



禽呼肠孤病毒强毒株和弱毒疫苗株感染Vero细胞的蛋白质组学研究

黄莉，谢芝勋*，谢丽基，邓显文，谢志勤，范晴，罗思思，黄娇玲，曾婷婷，张艳芳，王盛

(广西壮族自治区兽医研究所 广西畜禽疫苗新技术重点实验室，南宁 530001)

摘要：为研究在禽呼肠孤病毒(ARV)不同毒力毒株感染后不同时间点宿主细胞中蛋白质组变化，运用双向凝胶电泳技术和质谱鉴定的蛋白质组学方法，对ARV 强毒株S1133、弱毒疫苗株aS1133感染Vero细胞和对照细胞在不同时间点的蛋白质样品进行检测。鉴定结果表明，共鉴定出44个差异表达蛋白质，这些蛋白质包括α-烯醇化酶(α-enolase)、过氧化物酶(Prx-4)、hnRNPs、微管蛋白(Tubulin)、蛋白磷酸酶、转录延伸因子等。 GO软件分析显示这些差异蛋白质主要参与细胞信号、细胞骨架组成、能量代谢、核酸代谢、蛋白质折叠、细胞增殖及凋亡等生物学功能。荧光定量RT-PCR验证表明，hnRNP和Prx-4在S1133感染细胞中表达水平持续上调，而Tubulin 和α-enolase 仅分别在48和24 h时表达上调，与双向凝胶电泳的结果一致。以上试验数据揭示了ARV不同毒力毒株感染后细胞中蛋白质表达的差异变化，有助于进一步阐明ARV和宿主之间的相互作用。

关键词：禽呼肠孤病毒；强毒株；弱毒疫苗株；Vero细胞；差异表达蛋白质

禽呼肠孤病毒(avian reovirus，ARV) 主要引起病毒性关节炎/腱鞘炎、矮小综合征及吸收不良综合征等，尤为严重的是诱发免疫抑制，造成机体对疫苗免疫应答能力和各种病原体抵抗力降低[1-3]。近年来，中国大多数省、区、市都有ARV感染的报道，其鸡群感染率可高达50%以上，已经成为鸡场中禽类免疫抑制病的主流，造成养禽业的经济损失，严重危害养禽业的健康发展[4-5]。ARV对宿主细胞的感染过程是病毒和宿主之间相互作用的结果和体现，会引起宿主细胞蛋白质表达模式发生改变。不同毒力的病毒感染宿主细胞后可导致宿主细胞启动不同的防御机制和蛋白质分子表达模式[6-7]。因此，利用蛋白质组学研究技术分析比较ARV强弱毒株感染前后宿主细胞蛋白质的表达变化，将为研究提供一个全新的视角来认识ARV与宿主细胞的相互作用关系，有助于在细胞水平上揭示病毒毒力不同对宿主细胞调控的差异，以及宿主细胞对此采取的相应应对策略，也有利于进一步阐明ARV感染机制。

随着近年来双向凝胶电泳方法、质谱鉴定等蛋白质组学技术的不断发展和日益完善，蛋白质组学研究已经成为研究病毒与宿主之间相互作用关系的有效高通量工具，并且在家禽病毒的研究中得到广泛应用，促进了家禽病毒研究的高速发展[8]。吴双等采用比较蛋白质组学方法，分析新城疫病毒不同毒力毒株感染鸡胚成纤维细胞后宿主蛋白质的表达变化，验证了新城疫病毒可以胞吞方式进入细胞，进而实现病毒的感染[9]。卢占军利用蛋白质组学技术研究马立克病毒超强毒株感染鸡法氏囊的蛋白质表达情况，筛选出与马立克病毒感染相关的一些重要宿主蛋白质，为深入研究马立克病致病性和致瘤性奠定基础[10]。ARV S1133是禽呼肠孤病毒的标准毒株，可以感染致病鸡群；而ARV aS1133是ARV S1133经鸡胚弱化形成的弱毒疫苗株，作为疫苗免疫，诱导免疫应答，保护鸡群抵抗禽呼肠孤病毒感染，两者的功能作用不同。因此，在本研究中，选择禽呼肠孤病毒标准毒株S1133和弱毒疫苗株aS1133感染Vero细胞作为研究对象，对比和比较体外宿主细胞蛋白质的表达变化，并对差异表达蛋白质进行初步的功能探讨，在体外水平上探索和阐明ARV不同毒力毒株和宿主细胞的相互作用，也为下一步开展体内研究提供试验基础。

1材料与方法

1.1主要试剂

尿素、硫脲、三羟甲基氨基甲烷、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、十二烷基磺酸钠(SDS)、过硫酸铵(APS)、四甲基乙二胺(TEMED)、甘氨酸、CHAPS(3-[(3-胆酰胺丙基)-二乙胺]-1-丙磺酸)、ASB-14，三正丁基膦(TBP)、甘油、IPG缓冲液(pH4～7)、碘乙酰胺、考马斯亮蓝G-250、溴酚蓝、标准蛋白质Marker、标准牛血清白蛋白(BSA)、双向电泳蛋白质定量试剂盒、矿物油和IPG干胶条(pH3-10、pH4-7)均购自GE Healthcare公司，二硫苏糖醇(DTT)、低溶点琼脂糖、蛋白酶抑制剂鸡尾酒混合液、DNase和RNaseI均购自Sigma公司。磷酸、乙醇、硫酸铵、乙酸、甲醇和盐酸均为国产分析纯。

1.2主要仪器

等电聚焦仪、Ettan IPGphor 3垂直电泳槽、Image Scanner Ⅲ LabScan 透射扫描仪、LabScan软件、ImageMaster 2D Platinum 6.0图像分析软件购自GE Healthcare公司；超声波破碎仪Vibra cellTM、紫外分光光度仪(ND-1000)购自美国Nano Drop公司；旋涡混合器WH-861、水平摇床(WD-9405B )购自北京六一仪器厂。

1.3细胞培养和病毒接种

Vero 细胞生长在含有10%胎牛血清的DMEM培养液中，培养在37 ℃ 5% CO2的培养箱中。培养成单层细胞后，接种104TCID50的禽呼肠孤病毒液，感染后第12、24和48 小时(hpi)收集细胞，用于蛋白质样品的制备和后续分析。

1.4细胞蛋白质样品的制备

将感染后的细胞和空白对照细胞分别收集，加入细胞裂解液(7 mol·L-1尿素，2 mol·L-1硫脲，2% CHAPS，20 mmol·L-1DTT，40 mmol·L-1Tris-CL，0.8% IPG缓冲液pH 4～7，1 mmol·L-1PMSF)进行裂解，离心取上清，转移至新的EP管中。并吸取20 μL裂解上清，测量蛋白质浓度，余下的蛋白质样品存于-70 ℃备用。

1.5 蛋白质样品的浓度测定和SDS-PAGE电泳

为了确保各个蛋白质样品上样量的一致性，在进行双向凝胶电泳前，按照Bio-Rad公司的Quick Start Bradford蛋白质检测试剂盒操作说明，对蛋白质样品进行定量分析。每个标准样品和待测样品均做3个重复。为了进一步确定蛋白质样品的提取完整性和上样量，根据待测样品的蛋白质浓度，调整各样品的上样体积，吸取同等量蛋白质，进行SDS-PAGE检测。

1.6水化和等电聚焦

将水化上样液和1 mg蛋白质样品溶液混合，终体积为500 μL，缓慢地加入聚焦槽中，再放入24 cm pH 4～7的干胶条，使其充分地浸泡。在每条胶条上覆盖1 mL矿物油，防止蛋白质样品挥发。将加好样品的聚焦槽放入等电聚焦仪中，按照表1设置程序，进行主动水化和等电聚焦。整个过程的温度设置为20 ℃，每条胶条限流为50 μA。

表1等电聚焦程序

Table 1IPGphor running conditions

1.7平衡和聚丙烯酰胺凝胶电泳

等电聚焦结束后，将胶条从聚焦槽中取出，进行平衡(平衡缓冲液Ⅰ：6 mmol·L-1尿素，2% SDS，0.375 mol·L-1Tris-Cl pH8.8，20%甘油，2% DTT；平衡缓冲液Ⅱ：6 mmol·L-1尿素，2% SDS，0.375 mol·L-1Tris-Cl pH8.8，20%甘油，2.5% 碘乙酰胺)。再将胶条转移到12% 聚丙烯酰胺凝胶上，进行第二向垂直电泳。电泳程序为80 V恒压下，跑胶30 min；然后在200 V恒定电压下，电泳约8 h。电泳结束后，进行考马斯亮蓝染色。

1.8图像扫描和软件分析

染色结束后，用扫描仪扫描采集图像。按照GE公司的使用说明书，采用ImageMaster 2D Platimun Software 7.01软件进行图像分析。

1.9质谱鉴定

将差异表达蛋白质点从凝胶中切下，置于1.5 mL EP管中，送广西大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室的蛋白质组学平台进行样品的质谱鉴定。

1.10差异蛋白质的GO分析

利用DAVID软件，对质谱鉴定出的差异蛋白质进行GO分析，预测和注释其分子功能、可能参与的生物过程以及pathway，并对其进行显著性分析，探讨和分析差异蛋白质在ARV感染过程中的功能和作用。

1.11差异蛋白质的Real-time RT-PCR验证

选择部分差异蛋白质，根据其在GenBank上发表的基因序列，设计特异引物(表2)，建立荧光定量RT-PCR检测方法。

2结果

2.1ARV S1133和aS1133感染Vero细胞

如图1所示，将104TCID50ARV S1133和aS1133感染Vero细胞后，从24 hpi开始，出现细胞变圆，细胞间空隙变大，到48 hpi时，细胞变圆聚集，出现明显病变，甚至部分细胞出现脱落，72 hpi时，细胞开始死亡，脱落。所以选取12、24和48 hpi的细胞，用于后续试验。

表2 荧光定量PCR检测差异表达蛋白质的引物序列

Table 2Primers used for detection of differentially expressed protein by qRT-PCR

2.2细胞蛋白质样品的制备

ARV S1133和aS1133感染 Vero细胞后的第12、24和48 小时，收集各组细胞，抽提蛋白质，用Bradford方法检测蛋白质样品的质量浓度，并调整为4～5 mg·mL-1，然后进行SDS-PAGE电泳，评估蛋白质样品的质量。若抽提的蛋白质样品条带完整清晰，可用于双向凝胶电泳。

2.3双向凝胶电泳分析

将S1133和aS1133分别感染的细胞蛋白质样品和对照细胞蛋白质样品，以同样的蛋白质量上样，进行双向凝胶电泳分析。为了减少试验误差，每个样品重复3次，采用相同的实验条件。凝胶染色扫描获得图像数据后，利用ImageMaster 2D Platium Software 7.01软件分析蛋白质点，选择表达差异≥2.0的蛋白质点为显著差异表达蛋白质点。结果显示，3个感染时间点样品中共筛选出显著差异表达蛋白质61个(图2)。

2.4质谱鉴定和分析

将表达差异显著的差异蛋白质点从凝胶中切下，胶内胰酶消化，进行MALDI-TOF MS/MS+MS串联质谱鉴定和分析，使用MASCOT搜索引擎对NCBI等数据库进行搜索，结果成功鉴定了44 个蛋白质点，属于33种蛋白质(表3～5)。在12 hpi时，上调表达的差异蛋白质有5个，下调蛋白质6个；24 hpi时，13个上调蛋白质，3个下调蛋白质；48 hpi时，13个上调蛋白质，4个下调蛋白质。

运用DAVID软件进行差异表达蛋白质的GO功能分析，差异蛋白质可以分为信号转导相关蛋白质(如heat shock protein 27，Peroxiredoxin-4，alpha-enolase)、生物代谢相关蛋白质(如thioredoxin domain-containing protein 5，hnRNP H1，hnRNP K)、生物合成转运相关蛋白质(如protein disulfide isomerase，peptidyl-prolyl cis-trans isomerase-like 3 isoform)、细胞骨架蛋白(如tubulin，tropomyosin alpha-3 chain isoform 3)以及未知蛋白质等(图3)。差异表达蛋白质的GO功能分析结果说明与ARV aS1133感染相比，细胞受到ARV S1133感染后，细胞骨架蛋白、与蛋白质结合转运折叠相关蛋白质、信号传导相关蛋白质和生物代谢相关蛋白质的表达发生改变，引起细胞正常结构的改变甚至破坏，细胞内外的信号传导调控、细胞蛋白质结构和功能的平衡维持被打破，最后导致细胞的生物合成和代谢也遭到破坏，这可能是由于ARV S1133和aS1133之间的毒力不同，进而对宿主细胞造成的影响也不同。

2.5荧光定量RT-PCR验证

为了验证双向凝胶电泳数据的准确性，选择4个差异表达蛋白质，以GAPDH基因作为内参基因，用荧光定量RT-PCR方法对其在12、24和48 hpi 时的基因转录水平进行验证。如图4所示，与aS1133感染的细胞相比，hnRNP和Prx-4在S1133感染细胞中转录水平持续上升，而Tubulin和a-enolase仅分别在48和24 h时转录上调，与双向凝胶电泳的结果一致。

表3ARV S1133和aS1133感染Vero细胞后12 h的差异表达蛋白质的质谱鉴定结果

Table 3Summary of differentially expressed proteins in Vero cells infected with ARV S1133 or aS1133 by MS at 12 hpi

表4ARV S1133和aS1133感染Vero细胞后24 h的差异表达蛋白质的质谱鉴定结果

Table 4Summary of differentially expressed proteins in Vero cells infected with ARV S1133 or aS1133 by MS at 24 hpi

表5ARV S1133和aS1133感染Vero细胞后48 h的差异表达蛋白质的质谱鉴定结果

Table 5Summary of differentially expressed proteins in Vero cells infected with ARV S1133 or aS1133 by MS at 48 hpi

3讨论

在本研究中，通过双向凝胶电泳结合质谱鉴定方法，寻找ARV强毒株S1133和弱毒疫苗株aS1133感染Vero细胞后不同时间点的蛋白质表达变化。结果显示，ARV强毒株感染细胞后，相比较于弱毒疫苗株，能够引起一些与细胞骨架、信号转导、生物合成与代谢等相关的蛋白质表达变化，包括微管蛋白、α-烯醇化酶、过氧化物酶等。

研究表明，许多病毒在感染宿主时，能够改变和利用细胞骨架蛋白，调控宿主生理活动过程中相关酶类蛋白质的活性和功能，以实现病毒的侵入、复制以及持续感染等[11]。X.Zheng等对传染性法氏囊病病毒感染鸡胚成纤维细胞的差异蛋白质组学进行分析，发现大量的细胞骨架蛋白质，如Tubulin、Viementin等在表达上发生显著性变化[12]。王晓虎发现狂犬病病毒感染N2a细胞时，诱导了α-烯醇化酶的上调，加速了糖酵解途径，减少氧化应激反应，以调节细胞生存期，维持狂犬病病毒的持续性感染[13]。此外，抗氧化物酶类蛋白质，如Peroxiredoxin-4(Prx-4)等，经研究证实是一个NF-κB信号通路和c-Jun N端激酶的硫氧还蛋白过氧化物酶相关激活剂，对清除细胞中的活性氧、细胞增殖、凋亡具有调控作用，还广泛参与细胞信号传导[14]。在本研究中，发现相比较于ARV S1133感染，aS1133 ARV感染细胞中这些蛋白质表达发生显著性改变，根据参考文献报道，推测Tubulin等细胞骨架蛋白质的表达上调可能与ARV感染宿主细胞过程中的细胞增殖、凋亡有关；hnRNP蛋白的表达上调可能与ARV感染时细胞能量代谢、核酸代谢的改变有关；α-烯醇化酶和Prx-4等蛋白质的上调表达可能与ARV感染时细胞的应答有关。这些结果也表明ARV不同毒株的毒力差异导致了感染细胞的应答结果不同，进而决定了病毒的感染进程和宿主的应答反应结果。

由于双向凝胶电泳技术的局限性，一些相对分子质量过大、过小的蛋白质或极性蛋白质不能检测出，并且也不能精确地定量出差异蛋白质在不同感染时间点的表达量变化，在以后试验中考虑采用其他方法做进一步研究。

4结论

采用双向凝胶电泳结合质谱鉴定的蛋白质组学技术，进行了禽呼肠孤病毒强毒株和弱毒疫苗感染宿主细胞后的蛋白质组学分析，获得了44个差异表达蛋白质，为进一步理解禽呼肠孤病毒感染致病机制和宿主免疫应答机制奠定了基础。

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(编辑白永平)

Proteomic Analysis of Vero Cells Infected by Avian Reovirus Virulent Strain and Attenuated Vaccine Strain

HUANG Li，XIE Zhi-xun*，XIE Li-ji，DENG Xian-wen，XIE Zhi-qin，FAN Qing，LUO Si-si，HUANG Jiao-ling，ZENG Ting-ting，ZHANG Yan-fang，WANG Sheng

(GuangxiKeyLaboratoryofAnimalVaccinesandNewTechnology，GuangxiVeterinaryResearchInstitute，Nanning530001，China)

Key words:avian reovirus；virulent strain；attenuated vaccine strain；Vero cells；differentially expressed proteins

Abstract:To discover protein expression changes in infected Vero cells with avian reovirus (ARV) virulent strain S1133 and attenuated vaccine strain aS1133，respectively，two dimensional gel electrophoresis (2-DE) and mass spectroscopy (MS) technologies were utilized to separate and identify the total proteins of Vero cells inoculated with ARV S1133 or aS1133 as well as control cells at desired time points post infection.The identification results showed that total 44 differently expressed protein dots were identified，including α-enolase，Prx-4，hnRNPs，tubulin，protein phosphatase，transcription elongation factor.These differentially expressed proteins were involved in various biological functions，including signaling transduction，cytoskeleton，metabolism，protein disfolding，cell proliferation and apoptosis.The results of quantitative RT-PCR validated the mRNA expression of α-enolase，Prx-4，hnRNPs and tubulin were in agreement with that of proteomic analysis.The present data highlighted protein expression differences in infected cells with ARV virulent strain and attenuated vaccine strain，which would contribute to further elucidate the interaction between ARV and hosts.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.02.016

收稿日期：2015-07-25

基金项目：国家自然科学基金(31160512)；广西自然科学基金(2014GXNSFCA118006)；广西特聘专家专项(2011B020)；广西水产畜牧兽医局科技项目(桂渔牧科201452003)

作者简介：黄莉(1978-)，女，广西南宁人，博士，主要从事禽病防治与病原分子生物学研究，Tel: 0771-3120371, E-mail: lhuang405@126.com *通信作者：谢芝勋(1963-)，研究员，主要从事畜禽传染病分子生物学研究，E-mail: xiezhixun@126.com

中图分类号：S852.659.4

文献标志码：A

文章编号:0366-6964(2016)02-0331-09