动物疫病研究新方法——数字式PCR技术

孙世宇

（辽宁省动物疫病预防控制中心，辽宁　沈阳110164）

动物疫病研究新方法
——数字式PCR技术

孙世宇

（辽宁省动物疫病预防控制中心，辽宁沈阳110164）

本文论述了数字式PCR技术的原理和发展过程，比较了不同数字式PRC技术的特点，展望数字式PRC技术应用于动物疫病研究中。

数字PCR；dPCR

PCR，PolymeraseChainReaction即聚合酶链式反应技术已经广泛应用于动物疫病的研究，大部分的动物疫病病原检测都建立起了相应的PCR方法，甚至一些PCR方法已经成为某些病原的检测标准，PCR方法也从早期的水浴扩增，凝胶电泳分析发展成为当前的热循环仪，实时荧光分析，应用技术越来越先进，PCR的检测结果也越来越精确，然而技术的发展没有停止，近年来出现了数字PCR技术，即Digital PCR（dPCR），开启了PCR技术的新革命。

1　数字PCR技术原理

PCR的原理，简单理解就是利用DNA（RNA同理）的半保留式复制，在不同温度下双链变性成为单链，按照碱基互补配对原则，利用聚合酶使目的核酸片段链式扩增，每次循环形成两倍数量的目的核酸分子，这样重复多个循环，目的核酸程指数增长，在几个小时之内获得百万个相同核酸分子，可以像“大海捞针”一样检测出样品中的阳性分子，但是这样的检测只能定性，无法定量分析。随后，人们探索出实时荧光定量的方法，通过在反应体系中加入荧光指示剂，每次循环检测荧光信号，设定荧光信号阈值（Ct值）及描绘标准曲线，间接地对PCR反应进行定量分析，这种方法很好地实现了定量分析，但受到序列含量、反应抑制等条件的影响，准确性有一定限制。

1999年，美国约翰霍普金斯大学的KennethKinzler和BertVogelstein构建了一种新的PCR方法，他们将样品稀释并分散到多个384样品板中，设想每个孔中含有极少量的目标分子，或不含有目标分子，经过反应，阳性孔判定为“1”，阴性孔判定为“0”，即“有或无”，这种方法成为了数字PCR的雏形，但是实验工作量巨大，反应效果也不稳定。2003年，他们对这种方法进行了改进，使用乳化剂将样品分散成数万个小液滴，使用磁珠法辅助进行反应，最终得到了成功，早期的数字PRC方法主要局限在样品的分散难度较大，随着技术的发展，通过微滴式、芯片式等方法，可以很均匀地将反应液体分散成极微小的液滴，大部分液滴只可以含有一个目标核酸分子，或不含有目标核酸分子，然后通过荧光读数的方法，就可以实现准确的定量分析。当然，反应体系中也会出现含有两个以上目标核酸分子的情形，这就需要在计算结果时使用概率统计的方式排除干扰，一般采用泊松分布原理进行计算。随后数字PCR开始商业化，市场上也出现了多种数字PCR仪，较成熟的有微滴式数字PCR仪和芯片式数字PCR仪。

2　两种数字式PCR技术对比

微滴式dPCR将样品反应体系分散约数万个油包水液滴，这样每份样品可以盛放在独立的微孔板小孔中，每个样品板就可以同时进行多个样品的检测，芯片式dPCR将样品均匀地分布在芯片上的数万个微孔中，这样每个芯片就只能容纳一个样品。微滴式dPCR采用类似流式细胞仪的读数方式，每个油包水液滴依次通过荧光计数器来读数，读数后样品即消耗，而芯片式dPCR则可以整个芯片照相读数，读数后芯片可以保留。

3　结语

与传统的PCR方法相比，数字PCR方法更加灵敏，可以在样品浓度较低时，发现目的片段，不需要依赖曲线和Ct值，将样品分散成数万个微滴，有或无进行数字化判定，定量分析更加准确，将样品分散成单独的微滴反应体系，也避免了其他物质的抑制效应，提高了实验的稳定性。可以预见，数字化PCR方法将会在动物疫病研究中发挥更广泛的作用。

［1］JeffreyM.Perkel，数字PCR革命［J］.科学，2014.4.

［2］胡伟，等.微滴式数字PCR技术用于生物样品种属鉴定和绝对定量［J］.法医学杂志，2014，10.

［3］李亮.基于数字PCR的单分子DNA定量技术研究进展［J］.生物化学与生物物理进展，2012，10.

10.3969/J.ISSN.1671-6027.2016.06.004