《中药大辞典》记载的抗真菌中药体外药效再评价

吴晶 王亮 曹永兵 阎澜 姜远英

(中国人民解放军第二军医大学药学院新药研究中心，上海 200433)

·论著·

《中药大辞典》记载的抗真菌中药体外药效再评价

吴晶 王亮 曹永兵 阎澜 姜远英

(中国人民解放军第二军医大学药学院新药研究中心，上海 200433)

目的 对《中药大辞典》中记载有抗真菌药理作用的127种中药醇提物进行体外抗深部感染真菌 (白念珠菌、新生隐球菌、烟曲霉)的研究。方法 采用75%乙醇超声提取法对127种中药进行统一提取，参考CLSI微量液基稀释法M27-A3和M38-A2方案进行抗白念珠菌、新生隐球菌、烟曲霉的最低抑菌浓度 (MIC)测定，并进一步考察其抗菌谱及抑制菌丝作用。结果 在2 mg/mL浓度下，仅博落回等17种中药、月季花等34种中药、黄柏等5种中药分别对白念珠菌、新生隐球菌、烟曲霉有抑制作用，其中博落回和粉萆薢的抗菌谱广；在4 mg/mL浓度下，127种中药中仅粉萆薢和藜芦能完全抑制菌丝生长，最低浓度分别为200 μg/mL和500 μg/mL。结论 首次用统一标准对《中药大辞典》中记载的抗真菌中药进行体外活性筛选，并对其药效进行再评价，为新型抗真菌药物开发提供理论依据和参考。

《中药大辞典》；抗真菌；中药；白念珠菌；新生隐球菌；烟曲霉

[Chin J Mycol，2016，11(6):348-353]

深部真菌感染的发病率和死亡率日益增加，临床上常见的抗真菌药物 (两性霉素B脂质体、氟康唑、棘白菌素类等)存在抗菌谱窄、耐药性严重、价格高且均有不同程度毒副作用等问题[1-2]。传统中药是中华民族的伟大宝库，历史悠久、临床疗效显著，在化学结构和作用机制方面均存在多样性，值得我们去深入挖掘。《中药大辞典 (第二版)》对中药的抗真菌药理活性和临床疗效有较为全面的收录，如收录的一枝黄花对红色毛癣菌有极强杀菌作用，其水煎醇提液有抗白念珠菌作用，其疗效与制菌霉素相当；丁香中丁香酚体外对多种皮肤癣菌有抑杀作用；白屈菜中白屈菜红碱和血根碱混合物具抗真菌作用，对犬小孢子菌和絮状表皮癣菌及烟曲霉有抗真菌活性；黄柏其水煎剂对多种致病性皮肤癣菌均有不同程度抑制作用；黄连其水煎剂对紫色毛癣菌、白念珠菌、絮状表皮癣菌等14种皮肤真菌呈抑制作用等。但其收录标准不一，对应的参考文献较为零散，且年代较早，不同实验室对中药的提取方法不一、筛选方法未能标准化，不能在同一水平进行活性强弱的比较，有些中药产生抗真菌活性的浓度较高，实际应用价值较低；且研究多数限于浅表部感染真菌，对深部真菌感染的探究较少[3-4]。目前日益严重的侵袭性真菌感染致死率高，从资源丰富的中药中寻找有临床应用价值的抗深部真菌感染药物有重要意义[5-7]。因此，本研究对《中药大辞典》中报道的具有抗真菌作用的中药再次进行考证，旨在建立科学、规范、实用、统一的标准对抗深部真菌作用进行体外药效再评价，并研究其对白念珠菌菌丝的抑制作用。活性较好的中药进一步扩大抗菌谱，探究其对非白念珠菌和常见皮肤癣菌的抑制作用，为中药现代化和新型抗真菌药物的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

菌株 白念珠菌 (Candidaalbicans)标准菌SC5314、敏感菌Y0109由美国华盛顿乔治敦大学的WilliamA.Fonzi教授惠赠，白念珠菌耐药菌 (Candidaalbicans)102、103、近平滑念珠菌 (Candidaparapsilosis)ATCC 22019、光滑念珠菌 (Candidaglabrata)537、新生隐球菌 (Cryptococcusneoformans)32609、石膏样小孢子菌 (Microsporumgypseum)、红色毛癣菌 (Trichophytonrubrum)、烟曲霉 (Aspergillusfumigatus)7544均由长海医院真菌室提供。所有菌株已经形态学和分子鉴定。

药物 127种中药材购自上海雷允上大药店、上海虹桥饮片厂、亳州同仁堂大药店；氟康唑 (Fluconazole，FLC)、伏立康唑 (Voriconazole，VCZ)及酮康唑 (Ketoconazole，KCZ)均购自美国Sigma公司，其他试剂均为国产试剂。

培养基 RPMI 1640液体培养液：RPMI 1640 10 g，NaHCO32.0 g，吗啡啉丙磺酸34.5 g，NaOH调pH至7.0，三蒸水定容1 000 mL，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌；4℃保存备用。Spider培养液 (pH 7.2)：营养肉汤10 g，甘露醇10 g，K2HPO42 g，三蒸水定容1 000 mL，高压灭菌，保存于4℃备用。YEPD培养液：酵母浸膏10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g，加三蒸水900 mL溶解，加入2 mg/mL氯霉素水溶液50 mL，三蒸水定容至1 000 mL，高压灭菌，于4℃保存。沙堡葡萄糖琼脂培养基 (SDA)：蛋白胨10 g、葡萄糖40 g、琼脂18 g，加三蒸水900 mL溶解，加入2 mg/mL氯霉素水溶液50 mL，调整pH值至7.0，定容至1 000 mL，高压灭菌，4℃保存[8]。

仪器 DL-1000B智能超声波清洗器 (上海之信仪器有限公司)，SW-CT-IF型单人双面超净化工作台 (苏州安泰空气技术有限公司)，96孔细胞培养板 (丹麦Nunclon公司)，12孔细胞培养板 (美国Corning公司)，80A漩涡混合器 (上海琪特分析仪器有限公司)，THZ-82A台式恒温振荡器 (上海跃进医疗器械厂)，隔水式电热恒温培养箱 (上海跃进医疗器械厂)，XW-Multiskan MK3型酶标仪 (芬兰Labsystems公司)，倒置显微镜 (美国AMG○REVOS公司)，单反相机 (日本Nikon公司)。

1.2 方法

中药的提取[9]中药材50 g研磨成粉末，过20目筛，5倍量的75%乙醇50℃浸泡24 h，超声提取30 min，2次，合并2次提取液，离心取上清液，得终浓度为200 mg/mL的生药提取液，置于4℃冰箱备用[1]。

阳性对照药物的配制 二甲亚砜 (DMSO)溶解FLC、VCZ、KCZ，配制成6.4 μg/mL药物母液，置于4℃冰箱备用。

酵母菌活化 于35℃ SDA，孵育24～48 h，挑取单个菌落接种至YEPD培养液，于30℃、200 r/min振荡培养16 h后，使其处于指数生长对数期，以保证菌的纯度和活力；丝状菌烟曲霉35℃马铃薯葡萄糖斜面培养基孵育7 d，无菌纱布过滤。

菌悬液配制[10-11]血细胞计数板计数，以RPMI 1640培养液调整酵母菌液浓度至 (0.5～2.5)×103CFU/mL、丝状菌液浓度 (0.5～2.5)×104CFU/mL用于药敏实验。离心收集生长对数期白念珠菌，用灭菌的PBS缓冲溶液 (pH 7.2)清洗3次，将白念珠菌细胞混悬于1 mL Spider培养液中，用血细胞计数板计数，调菌浓度为1.0×106cells/mL用于菌丝生长实验[10-11]。

药物敏感测试板的制备 按2009年和2008年CLSI推荐标准M27-A3和M38-A2方案[10-12]：取无菌96孔板，于每排1号孔加RPMI 1640液体培养基100 μL作空白对照；3～12号孔各加新鲜配制的菌液100 μL；2号孔分别加菌液198 μL和中药粗体物2 μL；2～11号孔进行2倍倍比稀释，使各孔的最终药物浓度分别为2 000、1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.813、3.906 μg/mL，各孔中乙醇的含量均低于1%。12号孔不含药物，只加菌液100 μL作生长对照。作为阳性对照药的FLC、VCZ和KCZ的终浓度分别为16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5和0.031 3 μg/mL。各孔中DMSO的含量均低于1%。药敏板于35℃隔水式电热恒温培养箱中培养，念珠菌和烟曲霉孵育48 h、新生隐球菌孵育72 h，用酶标分析仪于630 nm测各孔OD值，并辅以目测。

最低抑菌浓度 (MIC值) 与生长对照孔比较≥90%生长抑制所对应的最低药物浓度为氟康唑和中药提取物的MIC90。生长对照孔的OD值控制在0.2左右，与生长对照孔比，以OD值下降90%以上的最低浓度孔中的药物浓度为MIC90(真菌生长90%被抑制时的药物浓度)。中药提取物大多颜色较深可能产生假阳性结果，辅以目测，以肉眼观察无菌生长的最低浓度为最低抑菌浓度。每块药敏板均设有质控菌株及质控化合物，实验过程中质控株近平滑念珠菌ATCC22019、质控化合物氟康唑、伏立康唑、酮康唑MIC波动范围不超过1个药物梯度浓度，且均在CLSI-M27-A3和CLSI-M38-A2公布的质控菌株MIC标准范围内，即本研究中实验结果数据可靠。实验在不同时间段重复3次，3次结果不超过一个浓度差则可信，且以高浓度MIC为准，若不符，再次重复测定。

菌丝生长实验 在无菌12孔细胞培养板中，每孔加入1 mL菌悬液，加入含有不同药物浓度中药醇提取液 (乙醇含量低于5%)，37℃隔水式电热恒温培养箱中静止培养3 h，在EVOS xl型倒置显微镜下观察菌丝生长状况并拍照。

2 结 果

2.1 127种中药醇提物体外抗深部真菌结果

考虑到体外药敏实验MIC值与临床用药剂量的相关性，我们将MIC>2 000 μg/mL的中药视为没有抗真菌活性。按此标准，《中药大辞典》中收录的127种中药醇提物中，以下92种对白念珠菌、烟曲霉、新生隐球菌的MIC均>2 000 μg/mL，视为无效：八角科 (八角茴香)百部科 (百部)百合科 (黄精、石刁柏、知母、浙贝母)败酱科 (甘松)车前科 (车前草)唇形科 (薄荷、迷迭香)动物界 (蜈蚣)豆科 (番泻叶、黑大豆、苦豆子、望江南、皂荚、广金钱草)凤尾蕨科 (凤尾草)凤仙花科 (凤仙花、凤仙透骨草)橄榄科 (没药)谷精草科 (谷精草)禾本科 (麦芽)胡椒科 (胡椒)姜科 (山奈、生姜)堇菜科 (紫花地丁)桔梗科 (半边莲、沙参)菊科 (款冬花、艾叶、白术、苍耳子、苍术、菊花、蒲公英、一枝黄花)矿物 (白矾、雌黄、硫黄、硼砂、轻粉、自然铜)兰科 (白及)藜科 (地肤子、土荆芥)楝科 (苦楝皮)蓼科 (萹蓄、辣蓼、灵芝、蓼大青叶)麻黄科 (麻黄)马齿苋科 (马齿苋)马兜铃科 (马兜铃、细辛)毛茛科 (白头翁、石龙芮、唐松草、威灵仙)木通科 (木通、连翘)蔷薇科 (乌梅)茄科 (枸杞子)忍冬科 (金银花)伞形科 (防风、蛇床子、小茴香)桑科 (桑白皮、桑叶)莎草科 (香附)商陆科 (商陆)十字花科 (莱菔子、青黛)石榴科 (石榴皮)松科 (松节)天南星科 (水菖蒲)五加科 (海桐皮、刺人参)仙人掌科 (仙人掌)苋科 (倒扣草)绣线菊亚科 (木瓜)玄参科 (玄参、地黄)鸢尾科 (射干)芸香科 (白鲜皮、花椒、浙桐皮、枳实)樟科 (香叶)真菌界 (马勃)紫草科 (紫草)槟榔科 (槟榔)。

<2 000 μg/mL浓度下，博落回等17种中药对白念珠菌有抑制作用，月季花等34种中药对新生隐球菌有抑制作用，黄柏等5种中药对烟曲霉有抑制作用；月季花、丁香、肉桂对3株深部真菌均有抑制作用；博落回、月季花、藜芦、粉萆薢、硬水黄连、黄柏6种中药对白念珠菌抑制作用明显，MIC在31.25～250 μg/mL之间，且仅月季花和黄柏对烟曲霉有抑制作用，MIC为1 000 μg/mL和500 μg/mL。详见表1 (按白念珠菌抑制作用从大到小排序)。

2.2 抗菌效果较好的中药对10种常见致病真菌的MIC

博落回、月季花、藜芦、粉萆薢、硬水黄连、黄柏6种中药醇提物的白念珠菌MIC值均<250 μg/mL，抑制效果较好。因此，扩大其抗菌谱，对白念珠菌耐药菌株、非白念珠菌和常见皮肤癣菌进行探究。研究表明：博落回和月季花抑制白念珠菌效果较其他药材强，MIC在15.625～31.25 μg/mL；博落回和粉萆薢抗菌谱广，对7种真菌均有抑制作用。详见表2。

表1 35种中药醇提物对3种深部真菌的MIC值

Tab.1 The MICs of antifungal activity of ethanol extracts from 35 traditional Chinese medicine

编号中药名药材批号新生隐球菌32609(μg/mL)烟曲霉7544(μg/mL)白念标准菌sc5314(μg/mL)白念敏感菌Y0109(μg/mL)VCZ阳性对照药0.01560.250.01560.0625KCZ阳性对照药0.12540.1250.0625FCZ阳性对照药2>640.50.251博落回484915.625-31.2515.6252月季花09637.813100031.2515.6253藜芦588162.5-12562.54粉萆薢433062.5-2502505硬水黄连42007.813-2502506黄柏4202-5002502507丁香002231.2510005002508厚朴3430250-5002509白蔹1427250-100050010羊蹄197331.25-100025011大黄0181500-2000200012孩儿茶36741000-2000200013芦荟22302000-2000200014木香1501000-2000100015肉桂181612510002000200016土荆皮0160125-2000200017栀子33561000-2000100018白果1418500---19白屈菜14715001000--20藏茴香58331000---21草果3177250---22澄茄子5743250---23大风子0188500---24大蒜01832000---25广玉兰0450500---26红豆蔻20801000---27红毛七20681000---28槐花52751000---29藿香59222000---30决明子19472000---31牛蒡根08722000---32啤酒花45682000---33野升麻44411000---34使君子28782000---35香茅35062000---

注：-表示>2 000 μg/mL

2.3 考察对白念珠菌菌丝形成的影响

前期预实验发现75%乙醇含量高于10%能完全抑制菌丝形成，3%菌丝则正常生长。因此，我们选取最大测试体积为20 μL/孔 (乙醇含量为2%)，即最高药物浓度为4 mg/mL，作为粗步筛选最高浓度。通过考察127种中药醇提物对白念珠菌菌丝形成的影响我们发现：在4 mg/mL浓度下，这127种中药醇提物，仅粉萆薢和藜芦能完全抑制菌丝生长，完全抑制菌丝最低浓度分别为200 μg/mL和500 μg/mL (见图1)。

3 讨 论

《中药大辞典》载药6 008种，是收载药物较为全面的中医药领域工具书，对传统中药主要药理作用和临床应用均有较为详细的收录，其中以抗真菌药理作用进行检索，共收录202种。相比散见于各医药杂志和综合性医药书籍的药理作用研究，其收录较为全面，参阅便捷，但收载标准不一，无法比较抗菌作用强弱，以便更好发掘抗真菌新药[3-4]。因此我们首次针对3种常见深部感染真菌，用统一标准对《中药大辞典》中记载的具有抗真菌药理活性的中药醇提物进行了体外抗真菌作用再评价。但由于部分中药为冷背药材，获得渠道有限，目前我们仅研究其中127种。在后续的实验中，我们将尽力完善剩余中药的抗真菌活性评价。

目前，抗真菌中药研究的标准比较混乱，为保证方法上的统一性，在中药提取方面，实验前期我们将文献报道较好的中药 (黄连、黄柏等18味中药)进行了水提物、30%醇提、75%醇提的抗白念珠菌活性测定，以及参考部分研究[13]，发现同批中药75%乙醇提取物的抗真菌效果较好，且75%醇提物抗菌效果最好，能避免中药提取液被细菌污染，能保证实验的稳定性，同时超声提取法与传统中药水煎提取相比，具有提取效率高、适应性广、简单易行、重复性高的优势，因此本实验研究我们仅选取75%乙醇超声提取液来进行抗真菌作用的考察。为减少温度及操作误差对结果的影响，我们也尽量保证药物集中干燥、粉碎、恒温箱50℃浸泡24 h后提取。体外活性筛选方面，本研究采用美国临床实验室标准化协会 (CLSI)推荐的M27-A3和M38-A2微量稀释法，该方法简单易行，结果可靠、重复性好，便于实验室之间比较；MIC结构判定方面，采用机测与目测相结合的判定方法，以避免中药本身颜色可能对吸光度的影响。本研究结果均平行测试了3次以上，每次3个复孔，以保证结果的可重现性。诚然药材的产地不同、批号不同、亚种不同也会对其抗真菌活性造成误差，我们尽量确保来源的正规性，对有效中药进行不同来源的活性筛选，尽量减少偶然误差，以保证结果的可靠性。

表2 6种中药醇提物对10种常见致病真菌的抑制作用

注：-表示>2 000 μg/mL

图1 粉萆薢和藜芦对白念珠菌菌丝形成的影响

本实验部分结果与《中药大辞典》中报道的活性存在差异，如白矾、白鲜皮、连翘、山柰等药材报道中具有杀菌作用[3-4]，但是实验结果并未检测到活性，表明部分传统认为具有抗真菌活性的中药可能并无抗菌活性。但同时我们也应考虑由于不同的提取方法、测试菌株、实验方法以及有效浓度判定标准不一等因素所造成的体外药敏结果差异[13-15]和某些体外无抗真菌作用的中药，通过体内代谢或增强机体免疫力以达到抗菌作用的可能性，后续研究也从体内外两方面同时考察其抗菌活性。

同一中药对不同的菌株影响也不同，在扩大抗菌谱试验中，博落回、月季花、藜芦、粉萆薢、硬水黄连、黄柏对白念珠菌临床耐药菌也有较好的活性，其中博落回、粉萆薢、黄柏对白念标准菌和临床耐药菌MIC并无差异，表明了中药耐药性低的优势。博落回和粉萆薢对9株真菌有抑制作用，博落回对酵母菌的抑制作用强于粉萆薢，但对丝状菌的抑制作用弱于粉萆薢；对酵母菌抑制作用较好的藜芦、硬水黄连在测定浓度下对丝状菌并无作用，该结果提示我们深部真菌与浅部真菌的作用靶点可能不同。

本实验还探究了中药醇提物对白念珠菌菌丝形成的抑制作用，初步考察了中药对菌丝毒力的影响，发现在一定浓度范围下，仅粉萆薢和藜芦能完全抑制菌丝生长，进一步丰富了中药抗真菌的理论基础。

中药资源丰富、疗效好、毒副作用小、在我国有上千年的实践基础，对其进行系统、科学、现代化的基础研究，有助于理论数据的更新，更好的进行抗真菌新药的深入挖掘。但中药种类繁多，提取物中的化学成分及药理活性尚不能完全明确，致使抗真菌的物质基础和毒理反应亦不能明确。因此，下一步工作重点包括：横向方面，扩大筛选范围，对未报道具有抗真菌中药的空白领域进行活性考察，寻找高效低毒抗真菌中药；纵向方面，将体外活性较好的中药进行体内活性验证，并活性导向分离其有效成分，为研制新型抗真菌药物奠定基础。

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[本文编辑] 施 慧

《中国真菌学杂志》医学名词著录规范

以1989年及其以后由全国自然科学名词审定委员会审定、公布，科学出版社出版的《医学名词》和相关学科的名词为准，暂未公布者仍以人民卫生出版社编辑的《英汉医学词汇》为准。中文药物名称应使用1995年版药典 (法定药物)或卫生部药典委员会编辑的《药名词汇》(非法定药物)中的名称，英文药物名称则采用国际非专利药名，不用商品名。

Re-evaluation of the traditional Chinese medicines (TCMs) with antifungal activities recorded in ‘Zhong Yao Da Ci Dian’

WU Jing,WANG Liang,CAO Yong-bing,YAN Lan,JIANG Yuan-ying
(CenterforNewDrugResearch,CollegeofPharmacy,TheSecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China)

Objective To investigate the antifungal activity of 127 types of the traditional Chinese medicines (TCMs) with the so-called antifungal activities recorded in ‘Zhong Yao Da Ci Dian’ againstCandidaalbicans,CryptococcusneoformansandAspergillusfumigatusinvitro.Methods The portion from each TCM by 75% alcohol extracts were determined for antifungal activity againstC.albicans,C.neoformansandA.fumigatusby using the standard CLSI M27-A3 and M38-A2 broth microdilution assays,and further to study the antifungal spectrum and inhibition of hyphae.Results The ethanol extracts from 17 TCMs exhibited the inhibitory activity againstC.albicanswith MICs ranged from 15.625 to 2 000 μg/mL.34 kinds of ethanol extracts from TCMs had the inhibitory effect againstC.neoformans.5 ethanol extracts from TCMs had the inhibitory activity of inhibitingA.fumigatus.Conclusion The antifungal activities of TCMs which has been recorded in ‘Zhong Yao Da Ci Dian’ are measuredinvitroby the consistent standard method for the first time,providing the experimental basis for investigation of new antifungal agents.

‘Zhong Yao Da Ci Dian’；antifungal agents；minimal inhibitory concentration；Candidaalbicans；Cryptococcusneoformans；Aspergillusfumigatus

国家自然基金 (81273556)

吴晶，女 (汉族)，硕士研究生在读.E-mail:wjinghb69@163.com

姜远英,E-mail:13761571578@163.com

R 978.5

A

1673-3827(2016)11-0348-06

2016-09-22