龙胆泻肝汤氯仿提取物对白念珠菌VVC临床株菌丝抑制作用研究

王霞 吴大强 施高翔 段强军 邵菁 汪天明 汪长中

(1.安徽中医药大学 中西医结合临床学院，合肥 230038；2.安徽省中医药科学院 中西医结合研究所，合肥 230038)

·论著·

龙胆泻肝汤氯仿提取物对白念珠菌VVC临床株菌丝抑制作用研究

王霞1,2吴大强1,2施高翔1,2段强军1,2邵菁1,2汪天明1,2汪长中1,2

(1.安徽中医药大学 中西医结合临床学院，合肥 230038；2.安徽省中医药科学院 中西医结合研究所，合肥 230038)

目的 观察龙胆泻肝汤氯仿提取物 (chloroform extracts of Longdan xiegan decoction,CELX)对白念珠菌菌丝形成的影响，探讨其可能的作用机制。方法 采用微量稀释法测定龙胆泻肝汤不同溶剂提取物对15株VVC临床株的最低抑菌浓度 (minimal inhibitory concentration,MIC)；采用固体培养基和半固体培养基观测菌落形态及菌丝侵袭能力；XTT还原法评价白念珠菌菌丝活性；平板法计数6 h内药物对白念珠菌CFU的影响；荧光显微镜下观察菌丝代谢活力；采用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)检测其菌丝相关基因：ALS3、SSA1、SUN41、HWP1、UME6和ECE1的表达量。结果 CELX对15株VVC临床株MIC介于32～64 mg/L之间，效果优于总提物、石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物和水提取物的MIC；256 mg/L的CELX能显著抑制菌丝的形成；256 mg/L的CELX在固体培养基中可抑制菌落褶皱，在半固体培养基中可抑制菌丝侵袭；qRT-PCR结果显示256 mg/L CELX可使菌丝相关基因ALS3、SSA1、SUN41、HWP1、UME6和ECE1分别下调81.6%、60.2%、69.8%、73.7%、49.5%、52.8%。结论 龙胆泻肝汤氯仿提取物 (CELX)可通过影响菌丝相关基因的表达来抑制菌丝的形成，从而降低白念珠菌对机体的侵袭力。

龙胆泻肝汤；白念珠菌；外阴阴道念珠菌病；菌丝

[Chin J Mycol，2016，11(6):341-347]

外阴阴道念珠菌病 (vulvovaginal candidiasis，VVC)是一种主要由白念珠菌引起的阴道真菌感染性疾病，病情常迁延难愈，复发率较高，对妇女的身心健康影响较明显。氟康唑等西药虽有较好疗效，但易产生耐药性。中药用于治疗VVC具有独特的优势。其中，龙胆泻肝汤是临床上治疗VVC的常见方药。

龙胆泻肝汤[1]出自《医方集解》引《太平惠民和剂局方》，原方中龙胆草为君药，大苦大寒，泻火除湿；黄芩、栀子亦苦寒，泻肝胆湿热，助君药清热除湿为臣药；木通、泽泻、车前子清利肝经湿热；生地黄、当归养血滋阴，顾护肝体，标本兼顾。柴胡疏畅肝胆之气，引诸药入肝胆经；以上共为佐药，甘草和中调和诸药，为佐使药。方中诸药合用，共奏泻肝胆实火，清下焦湿热。在妇科疾病的治疗方面，龙胆泻肝汤已成为历代医家所广泛应用的良方[2]。本实验主要探讨龙胆泻肝汤对白念珠菌VVC临床株的重要致病物质——菌丝侵袭力的干预作用及机制，以期为治疗白念珠菌VVC 感染提供依据。

1 材 料

1.1 菌株与药物

白念珠菌标准株SC5314及质控菌株近平滑念珠菌ACTT22019由第二军医大学药学院姜远英教授惠赠。15株白念珠菌VVC临床分离株由合肥市第一人民医院妇产科陶瑞雪主任及安徽省立医院检验科鲁怀伟主任惠赠。龙胆泻肝汤复方中10味中药 (龙胆草、黄芩、栀子、木通、泽泻、车前子、生地、当归、柴胡、甘草)购于安徽中医药大学第一附属医院中药房，并经鉴定。

1.2 试剂

甲醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇均为分析纯，由上海中试化工总公司提供，溶壁酶 (SIGMA公司)，Total RNA提取试剂及PCR反应试剂 (日本TOYOBO公司)，引物 (上海生工生物工程有限公司)。

1.3 培养基

RPMI 1640液体培养基，1 mol/L NaOH溶液调整该液体培养基在25℃的pH为7.0±0.1，滤过除菌，4℃保存备用。沙氏液体培养基 (青岛高科技海博生物技术有限公司)，YPD培养基 (北京陆桥技术责任有限公司)。

1.4 仪器

RE2000B旋转蒸发仪 (上海亚荣生化仪器厂)；96孔微量培养板 (美国康宁公司)；DPH-9162型电热恒温培养箱 (上海一恒科技有限公司)；血细胞计数板 (上海求精生化试剂仪器有限公司)；CKX41-32型倒置显微镜 (日本OLYMPUS公司)；ABI7000荧光定量PCR仪 (美国生物应用系统公司)。

2 方 法

2.1 龙胆泻肝汤提取物的制备

将龙胆泻肝汤按5倍量80%甲醇水溶液加热 (70℃)冷凝回流4次，每次3 h，过滤，滤液合并，用旋转蒸发仪浓缩挥干，有机溶剂用水分散，然后依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，分别得到石油醚提取物、氯仿提取物、乙酸乙酯提取物，正丁醇提取物，并将各溶剂提取物用旋转蒸发仪浓缩，充分蒸干溶剂，最终得到相应的固体浓缩物。

2.2 菌悬液的配制

从4℃保存的沙氏固体培养基上挑取白念珠菌VVC临床株单个菌落，接种至沙氏液体培养液中，37℃、200 r/min培养16 h，用血细胞计数板计数，再用RPMI 1640培养液稀释至2×106CFU/mL，备用。

2.3 微量稀释法测定龙胆泻肝汤不同溶剂萃取物对白念珠菌VVC临床株的最低抑菌浓度 (minimal inhibitory concentration,MIC)

依据CLSI的M27-A3方案[3],先按二倍稀释法配制不同浓度提取物，使其终浓度为2 048、1 024、512、256、128、64、32、16、8 mg/L，按每孔100 μL加入96孔板中，再加入2.0×103CFU/mL菌体的混悬液100 μL，37℃培养48 h，以肉眼观察无菌生长的最小药物稀释度作为各菌株的MIC。同时设培养基空白对照和培养基加菌体 (不含药物)的阴性对照 (或称生长对照)，实验重复3次，选取效果最好的溶剂萃取部位进行下一步实验。实验证实氯仿提取物 (chloroform extracts of Longdan xiegan decoction,CELX)的抑菌效果最好，故后续实验均采用该提取物。

2.4 液体培养基中观察菌丝形态

取100 μL白念珠菌菌悬液 (2×106CFU/mL)与100 μL终浓度为256、128、64 mg/L的龙胆泻肝汤氯仿提取物 (chloroform extracts of Longdan xiegan decoction,CELX)于96孔板中混合，同时设置空白组、氟康唑阳性对照药 (32 mg/L)组。37℃培养箱中培养6 h后，用光学显微镜观察并用相机拍摄其菌丝形态。

2.5 固体培养基上观察菌落形态

配制YPD固体培养基，分别加入终浓度为256、128、64 mg/L的CELX。用倍比稀释法将白念珠菌菌悬液稀释至20 CFU/mL，用微量移液器吸取100 μL，均匀涂布于YPD固体培养基上。同时设置空白组、氟康唑阳性对照药 (32 mg/L)组。在37℃培养箱中培养4 d后，用光学显微镜观察并用相机拍摄其菌落形态。

2.6 半固体培养基中观察菌丝侵袭现象

配制YPD半固体培养基[4]，加入终浓度为256、128、64 mg/L的CELX。用倍比稀释法将白念珠菌菌悬液稀释至20 CFU/mL。取100 μL于半固体培养基上，用稀释涂布法均匀涂布，同时设置空白组、氟康唑阳性对照药组。37℃培养5 d后切开培养基，拍摄横切面白念珠菌丝侵袭程度。

2.7 XTT还原法评价白念珠菌菌丝活性

将100 μL白念珠菌菌悬液 (2×106CFU/mL)与100 μL终浓度为256、128、64 mg/L的CELX于96孔板中混合，同时设置空白组、氟康唑阳性对照药 (32 mg/L)组。37℃培养箱中培养6 h后吸弃培养液，无菌PBS洗去未黏附菌，各孔加入60 μL XTT，避光培养2 h后,于492 nm处测吸光度。

2.8 平板法计数6 h内白念珠菌CFU

将2 mL含CELX液体培养基与2 mL菌液 (2×106CFU/mL)混合后加入24孔板中使其成为终浓度为256、128、64 mg/L的CELX的菌液，同时设置空白组、氟康唑阳性对照药 (32 mg/L)组。37℃培养箱中分别培养2 h、4 h、6 h后取出，微量移液器吸取100 μL菌液置于新试管中，加入PBS液稀释后，吸取100 μL菌液均匀涂布于沙氏固体培养基上。37℃培养箱中培养24 h后，计数CFU。

2.9 荧光显微镜下观察菌丝代谢活力

取1 mL菌液 (2×106CFU/mL)与1 mL终浓度分别为256、128、64 mg/L CELX于6孔板中混合，每孔分别置入一张无菌洁净盖玻片，37℃，200 r/min培养6 h后取出玻片，无菌PBS漂洗3次，10 mmol/L FUN1荧光染料避光染色30 min，荧光显微镜观察并拍照。

2.10 qRT-PCR检测菌丝相关基因的表达

白念珠菌总RNA的提取 2 mL菌液与2 mL终浓度分别为256、128、64 mg/L CELX混合，37℃，200 r/min作用6 h后，离心收集菌体，用无菌PBS冲洗3次后进行总RNA的提取。具体操作方法参照ToyoBo公司MagExtractor-RNA-提取试剂说明书进行。

引物的设计与合成 根据NCBI基因库查得所需基因序列，并用Primer Premire 5.0软件设计所需引物，委托上海生工合成引物，各引物情况见表1。

表1 各引物序列表

反转录为cDNA 遵照ToyoBo公司ReverTraAce qPCR RT Master Mix with gDNA Remover试剂盒说明的反应条件将提取的总RNA反转录成cDNA，反应配置均在冰上操作。具体如下：6 μL RNA先变性 (65℃ 5 min，4℃ 1 min)，然后加入其他反应试剂[4×DNA master (55 μL)：gDNA remover (1.1 μL)] 2 μL,5RT-Master MixⅡ 2 μL混合后按如下操作进行反转录：50℃ 5 min；98℃ 5 min；4℃ 1 min。反应完成后将cDNA稀释10倍备用。

实时荧光定量PCR反应 采用SYBR Green Real time PCR Master Mix试剂盒,按下列组成配制PCR反应，总反应体系为25 μL：2×SYBR Green Real time PCR 12.5 μL，PCR Forward Primer (10 μmol/L) 1 μL，PCR Reverse Primer 1 μL，cDNA 0.5 μL，ddH2O 10 μL。扩增反应在ABI7000荧光定量PCR仪上进行，反应条件：预变性95℃ 60 s；扩增定量程序40个循环，循环参数为：变性95℃ 15 s；退火55℃ 15 s；延伸72℃ 45 s；熔解曲线：60～95℃，加热速率为0.1℃/s。内参基因为ACTIN。每个样品均设置3重复，实验重复3次。

定量分析 实时荧光定量PCR分析，分别测定目的基因ALS3、SSA1、SUN41、HWP1、UME6和ECE1及内参ACT1的CT值，实验结果取其平均值。采用相对定量方式表示各样品目的基因的表达量，计算⊿CT=CT目的基因-CT内参基因及2-⊿⊿CT值，2-⊿⊿CT表示目的基因相对于内参基因的表达倍数。

2.11 统计学处理

3 结 果

3.1 龙胆泻肝汤各萃取部位对白念珠菌VVC临床株的MIC

相较于其他萃取部位，CELX对15株VVC临床株的抑菌能力最强，MIC为32～64 mg/L，氟康唑对标准菌株SC5314的MIC为0.5 mg/L，在正常范围之内 (见表2)。因有11株临床株的MIC为64 mg/L，故选取一株该抑菌浓度的VVC临床株CA14进行进一步实验。

3.2 液体培养基中CELX作用6 h后对白念珠菌菌丝形态影响

倒置显微镜下观察到，空白对照组有大量菌丝，纵横密集交织；64 mg/L CELX组较对照组菌丝相有所减少，并可见一定量的酵母相；128 mg/L CELX组有大量的酵母，只有少量菌丝；256 mg/L CELX组则均为酵母相，氟康唑作为阳性对照药，在浓度为32 mg/L时，有大量酵母相，可见少量菌丝相。如图1。

表2 各溶剂萃取部位对VVC临床株的MIC (mg/L)

Tab.2 The MICs of extracts toCandidaalbicansisolated from VVC (mg/L)

菌株总提物石油醚氯仿乙酸乙酯正丁醇水提物氟康唑SC53145121024128512102410240.5CA0151210243251210245121CA02512102432512102451216CA03512102464256102410244CA04512102464512102410244CA05512102464256512102432CA06512102464256512102432CA0751210243225651251216CA085121024642565125124CA09102410246425651210244CA101024102464512102410248CA111024102464512102410248CA1210241024645121024102416CA135121024322565125122CA14512102464256512102432CA1510241024645121024102464

3.3 CELX对白念珠菌在固体培养基上菌落形态与半固体培养基中菌丝侵袭能力的影响

观察固体培养基上菌落形态发现，空白对照组菌落边缘呈锯齿状，表面出现可视菌丝且渗透培养基内部，64 mg/L CELX低剂量组菌落边缘呈锯齿状，培养基内部菌丝变短，128 mg/L、256 mg/L CELX组则观察不到褶皱，边缘光滑。阳性对照组为32 mg/L氟康唑，其菌落表面皱缩，边缘平滑。

半固体培养基中，空白对照组菌丝能够深入培养基内部，而随着CELX组药物浓度的不断增加，其菌丝长度越来越短，256 mg/L CELX组菌丝则完全消失。32 mg/L氟康唑阳性药对照组其菌丝较短，呈簇状。见图2。

3.4 XTT还原法评价CELX对白念珠菌菌丝活性的影响

CELX与白念珠菌作用6 h后，与空白对照组相比，64 mg/L用药组吸光度有所降低，但无统计学意义，128 mg/L、256 mg/L用药组白念珠菌菌丝代谢活力显著下降，结果有统计学意义。见图3。

3.5 平板法计数6 h内药物对白念珠菌CFU的影响

通过平板计数菌落形成单位数量，根据稀释倍数计算原始CFU后，发现在培养4 h、6 h时，256 mg/L组能明显抑制白念珠菌的生长。见图4。

3.6 荧光显微镜下观察菌体形态及代谢活力

FUN1染色后，荧光显微镜下空白对照组有大量菌丝，相互交错，且荧光呈黄色，表明代谢旺盛；随着用药组CELX浓度的增加，菌丝量逐渐减少，CELX浓度为128 mg/L时，可见少量菌丝，荧光呈绿色，显示代谢开始减弱，256 mg/L CELX用药组中则均为酵母相，绿色荧光偏暗；阳性对照药组中未见菌丝，可见绿色荧光。见图5。

3.7 CELX对VVC临床株菌丝相关基因的表达的影响

与空白对照组相比，CELX在64 mg/L时，ALS3下调了61.5%，128 mg/L时，ALS3、SUN41、HWP1分别下调了67.3%、57.3%、56.9%；256 mg/L时，除UME6外，ALS3、SSA1、SUN41、HWP1、ECE1分别下调了81.6%、60.2%、69.8%、73.7%、52.8%。见图6。

4 讨 论

在正常情况下，白念珠菌以一定数量的酵母相定植于人体黏膜表面并不引起疾病。然而，在机体免疫力低下或菌群失调时，白念珠菌通过二相性形态转化即由酵母相形成菌丝相，同时产生水解酶如分泌型天冬氨酸蛋白酶 (SAP)、磷脂酶、脂肪酶等，实现对宿主细胞尤其是黏膜细胞的侵袭[5]。现认为，外阴阴道念珠菌病 (VVC)的发生与阴道微环境改变或局部免疫功能减退导致白念珠菌大量繁殖，并由酵母相转变为菌丝相进而侵袭阴道黏膜细胞导致阴道炎症损伤密切相关[6]。

此前，本课题组已经证实，龙胆泻肝汤提取物对白念珠菌生物膜具有一定的抑制作用[7]，但对其重要致病物质——菌丝的侵袭力是否具有干预效应尚不清楚。本实验首先通过测定龙胆泻肝汤各提取部位 (石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水)对15株白念珠菌VVC临床株的最小抑菌浓度 (MIC)，证实龙胆泻肝汤氯仿提取物 (CELX)为最佳的提取部位，其MIC为32～64 mg/L，远低于其他提取物，表明CELX对白念珠菌具有显著的抑制作用。同时选取了一株具有代表性的VVC临床菌株进行后面的一系列实验。

在本实验通过液体培养基的观察发现，256 mg/L的CELX能显著抑制菌丝的形成。在固体培养基中，空白对照组菌落表面出现可视菌丝且深入培养基内部，菌落边缘呈锯齿状。用药组均未见丝化现象，且随着用药剂量的增加，菌落边缘逐渐平整光滑，菌落中心皱缩越来越小。

外阴阴道念珠菌病 (VVC)中，菌丝可以通过主动侵入阴道黏膜细胞间隙继而侵害表皮细胞层[8]，本实验中半固体琼脂培养基实验，其凝固后的琼脂内形成的孔状结构可以一定程度上代表细胞间的间隙。在该实验中，空白对照组菌丝能够深入培养基内部，而随着用药组浓度的不断增加，其菌丝长度越来越短，图片显示256 mg/L CELX组菌丝则完全消失。总之，液体培养基、固体培养基、半固体培养基的实验结果均显示了CELX对VVC临床菌株菌丝的抑制作用，且呈剂量依赖性。

为了检测不同浓度CELX对白念珠菌代谢活力及形态影响，以FUN-1荧光染料进行染色，荧光显微镜下观察。本实验中，空白对照组中有大量菌丝相互交错，且由于菌丝代谢活性旺盛，其菌丝的荧光呈黄色 (红移)，随着用药组浓度的增加，菌丝相逐渐减少，荧光偏向与原始的绿色 (蓝移)，表明菌丝受到抑制且代谢活性降低。同时，通过XTT还原法和平板法计数白念珠菌CFU，进一步验证了256 mg/L CELX能影响白念珠菌的代谢活性。

为了进一步了解CELX对VVC临床菌株菌丝的作用，本实验采用了qRT-PCR法检测ALS3，SSA1，SUN41，HWP1，UME6，ECE1等菌丝相关基因的表达量[9-11]。其中，ALS3，SSA1基因所编码的产物 (als3p，ssa1p)又称为“侵袭素”，能与宿主细胞相应的受体 (如N-钙粘蛋白、E-钙粘蛋白等)结合，诱导宿主细胞对菌体的内吞进而造成侵袭损害[12-13]。本实验结果显示，除UME6外，ALS3，SSA1，SUN41，HWP1，ECE1均呈不同程度的下调，说明CELX可能通过影响菌丝相关基因表达来抑制菌丝的形成从而降低白念珠菌对机体的侵袭能力。

中药氯仿提取物中一般含有游离生物碱、有机酸、黄酮及香豆素类等成分，龙胆泻肝汤是由10味中药组成的复方，其CLEX提取物中抗白念珠菌菌丝的的主要有效成分以及作用机制值得进一步探讨。

图1 RPMI 1640液体培养基中CELX对白念珠菌菌丝形态的影响 (×400)：a.空白对照组,b.64 mg/L CELX,c.128 mg/L CELX,d.256 mg/L CELX,e.32 mg/L氟康唑 图2 CELX对白念珠菌在固体培养基上菌落形态与半固体培养基中菌丝侵袭能力的影响：a,f,k.空白对照组;b,g,l.64 mg/L CELX;c,h,m.128 mg/L CELX;d,i,n.256 mg/L CELX;e,j,o.32 mg/L氟康唑 (a～e为相机拍摄的固体培养基上菌落形态，f～j为显微镜下固体培养基菌落边缘的形态 (×40)，k～o为显微镜下半固体培养基中菌丝向内侵袭形态 (×40)) 图3 CELX对白念珠菌菌丝活性的影响 (与空白组相比，*P<0.05，**P<0.01) 图4 平板法计数6 h内药物对白念珠菌CFU的影响 (与空白组对比，*P<0.05) 图5 荧光显微镜下不同浓度CELX对白念珠菌丝代谢活力及形态影响 (×400)：a.空白对照组,b.64 mg/L CELX,c.128 mg/L CELX,d.256 mg/L CELX,e.32 mg/L氟康唑

Fig.1 The effect of CELX against hyphae formation ofCandidaalbicansFig.2 The effects of CELX on colonies on solid media and invasive growth in semi-solid media forCandidaalbicansFig.3 The activity of hyphae ofC.albicanstreated by CELX for 6 h (Compared with control group,*P<0.05，**P<0.01) Fig.4 CFU variation of plate assay count (Compared with control group,*P<0.05) Fig.5 Fluorescence microscopic images ofCandidaalbicanshyphae treated with CELX

图6 CELX对VVC临床株菌丝相关基因的表达的影响 (与空白组相比，*P<0.05，**P<0.01)

Fig.6 Expression of hyphae-specific genes ofCandidaalbicanstreated CELX by qRT-PCR (Compared with control group,*P<0.05，**P<0.01)

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[本文编辑] 王 飞

Inhibitory effects of chloroform extracts of Longdan xiegan decoction against hyphae formation ofCandidaalbicansisolated from VVC

WANG Xia，WU Da-qiang，SHI Gao-xiang，DUAN Qiang-jun，SHAO Jing，WANG Tian-ming，WANG Chang-zhong

(SchoolofIntegratedTraditionalandWesternMedicine，AnhuiUniversityofChineseMedicine,InstituteofIntegratedTraditionalandWesternMedicine，AnhuiAcademyofChineseMedicine,Hefei230038)

Objective To investigate the effects of chloroform extracts of Longdan xiegan decoction (CELX) against hyphae formation ofCandidaalbicansclinical strains isolated from Vulvovaginal Candidiasis (VVC).Methods Microdilution method was used to determine the minimal inhibitory concentrations (MICs) of Longdan xiegan decoction extracts againstC.albicansisolated from VVC.Solid agar and Semi-solid agar were utilized to evaluate colony morphology and invasive growth ofC.albicans,respectively.XTT and Fluorescence microscope assay were applied to determine the metabolic activity of hyphae ofC.albicanstreated by CELX for 6 h.Plate assay counted CFU variation.Quantitative Real-time PCR (qRT PCR) was adopted to analyze the expression of hyphae-specific genes includingALS3,SSA1,SUN41,HWP1,UME6 andECE1.Results The MICs of CELX againstC.albicansstrains were between 32 and 64 mg/L,which were better than MICs of total extract,petroleum ether extract,ethyl acetate extract,buty alcohol extract and water extract.CELX with concentration of 256 mg/L inhibited hyphae formation and influenced colony morphology significantly,with the wrinkle in solid agar and invasion in semi-solid agar being blocked.The expression of hyphae formation related genes,ALS3,SSA1,SUN41,HWP1,UME6 andECE1 were down-regulated by 81.6%,60.2%,69.8%,73.7%,49.5%,52.8%.Conclusion Our results suggested that CELX could inhibit hyphae formation through repress hyphae-relative genes expression to reduce the invasive activity against patient.

Longdan xiegan decoction；Candidaalbicans；vulvovaginal candidasis (VVC);hyphae

国家自然科学基金 (81573725)；安徽省自然科学基金 (1408085MH165，1508085MH163)

王霞，女 (汉族)，硕士研究生在读.E-mail:1158880238@qq.com

汪长中,E-mail:ahwcz63@sina.com

R 379.4

A

1673-3827(2016)11-0341-07

2016-08-08