基于核磁共振技术的卵巢静止奶牛血浆代谢谱分析

许楚楚，夏　成，孙雨航，肖鑫焕，王　刚，舒　适，张洪友，徐　闯，杨　威

(黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319)



基于核磁共振技术的卵巢静止奶牛血浆代谢谱分析

许楚楚，夏成*，孙雨航，肖鑫焕，王刚，舒适，张洪友，徐闯，杨威

(黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319)

摘要：为研究卵巢静止奶牛与发情奶牛体内差异代谢物变化，选取产后60～90 d的年龄、胎次、体况相近的健康经产高产奶牛作为实验动物。根据奶牛发情表现、直肠检查和B超检查及激素检测的结果，选取10头奶牛为发情组(A)，10头奶牛为卵巢静止组(B)，然后对两组奶牛血浆样品进行无偏性的1H谱核磁共振检测，对比其血浆代谢组学图谱，进行多元统计分析，筛选及鉴定卵巢静止奶牛血浆差异代谢产物，并进行生物信息学分析。结果显示：相对于正常发情奶牛，卵巢静止奶牛血浆中共12种代谢产物表现异常，包括水平增加的乙酸、柠檬酸和酪氨酸，以及水平下降的低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白、脂质、丙氨酸、丙酮酸、肌酸、胆碱、磷酸胆碱和甘油磷酸胆碱等；这些代谢产物与糖代谢、氨基酸代谢、脂蛋白代谢和胆碱代谢的异常密切相关；通过参与生物合成通路调节，干扰了奶牛正常卵泡生长。并且发现卵巢静止的奶牛血浆肌酸浓度降低和酪氨酸浓度升高的新变化。多种代谢异常提示奶牛卵巢静止与泌乳早期能量负平衡有关，并有伴发酮病和脂肪肝病的风险；另外，卵巢静止奶牛血浆肌酸、胆碱浓度降低和酪氨酸浓度升高的变化，为今后更为深入研究奶牛卵巢静止发生机制提供了新的方向。

关键词：奶牛；卵巢静止；核磁共振技术；血浆差异代谢物

卵巢静止是奶牛产后乏情的一种常见类型，是卵巢机能不全的一种表现，是由于卵巢机能暂时性扰乱，机能减退，处于静止状态，不出现周期活动。卵巢静止在奶牛卵巢疾病中约占26.3%，在奶牛乏情中发病率最高[1]。其病因主要是长期饲料不足或质量差，特别是蛋白质、维生素A及维生素E的缺乏，导致营养状况较差，机体长期处于能量负平衡状态，抑制了促性腺激素释放激素(GnRH)和促黄体素(LH)脉冲性分泌，造成GnRH和LH分泌不足，降低了卵巢对LH刺激的反应性，抑制了优势卵泡的发育，使奶牛不出现周期性活动[2]。饲养管理不善，泌乳过度，子宫、卵巢疾病，全身的严重疾病等会引起卵巢静止，因此，应把卵巢静止看作是各种原因引起的生殖机能障碍[3]。

近几年，随着代谢组学技术逐渐成熟和完善，液相色谱串联质谱、气相色谱串联质谱和NMR等三大代谢组学平台技术已被应用于筛选奶牛乳热诊断生物标志物[4]、筛选奶牛酮病生物标志物[5]以及比较奶牛Ⅰ型、Ⅱ型酮病致病机制[6]等。奶牛产后发生卵巢静止受到多种因素的影响，并且生物体的新陈代谢活动比较复杂，且具有动态性，而上述研究和临床实践经验往往因其单一性和片面性无法系统、客观地描述奶牛卵巢静止时体内代谢的变化。因此，作者通过运用代谢组学中的无偏性的1H谱核磁共振(1H nuclear magnetic resonance，1H NMR)技术对卵巢静止的奶牛和正常发情的奶牛的差异代谢物进行分析，旨在阐明奶牛乏情时体内整体代谢的差异变化，为今后较为深入地研究奶牛产后发生卵巢静止的发生机制和防治新策略提供理论依据和方法学基础。

1材料与方法

1.1实验动物

试验在黑龙江省某集约化牛场进行，该牛场按照中国泌乳奶牛饲养标准进行规范管理，散栏式饲养，自由采食全混合日粮(TMR)。随机选取产后60～90 d的年龄、胎次、体况相近的上年度年产10 t左右的健康经产奶牛共206头，作为备选动物。

正常发情奶牛：产后60～90 d自然发情，发情症状明显，直肠检查和B超检查子宫无异常，卵巢无异常且有成熟的排卵卵泡，处于排卵期的奶牛；同时，FSH、LH、E2、P4等四种激素水平符合正常奶牛发情模式[7]，即E2较高，P4较低，FSH和LH也较高。

卵巢静止奶牛：产后60～90 d不发情，无发情症状，直肠检查子宫无异常，卵巢无异常且无成熟的卵泡，双侧卵泡处于静止状态的奶牛；同时，FSH、LH、E2、P4等四种激素水平符合双侧卵巢静止类型的奶牛乏情模式[7]，即E2、P4、FSH和LH都较低，且E2和P4明显降低。

根据奶牛发情和卵巢静止判定标准，同时排除异常样本，本试验共选取10头表现发情且临床检查无其他疾病的健康奶牛为发情组(A)。10头卵巢静止且临床检查无其他疾病的奶牛为卵巢静止组(B)。

1.2血液样品采集及奶牛资料收集

所有奶牛分别于上午8点至11点之间进行尾根静脉采集血液，每头奶牛采集10 mL全血，置于加有3～5滴肝素钠的抗凝管中，倒置一次充分将抗凝剂和血液混匀后静止放置。然后迅速低速(4 000 r·min-1)离心5 min，用移液枪吸出上清液，每600 μL置于一个1.5 mL的EP管中，然后进行高速离心，以12 000 r·min-1的速度离心5 min，再分别提取500 μL上清液置于1.5 mL的EP管中，然后-80 ℃冷冻保存，待测。

1.3试验奶牛血浆1H NMR试验

对采集样品进行血浆样品制备后进行1H NMR检测，1H NMR图谱数据处理，化合物指认，多元统计分析包括主成分分析(principal component analysis，PCA)和偏正交最小二乘法分析 (orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA)，并对相应模型进行验证。之后进行差异代谢物代谢通路归属分析，采用KEGG数据库对两组奶牛血浆样本进行代谢组学差异代谢产物的互作网络构建分析[8]。

2结果

如图1所示，A、B分别为发情和乏情组奶牛血浆样本中有代表性的两个样品的1H NMR一维谱图，图中所有信号峰包含在0.5～8.5 ppm内(ppm表示化合物的化学位移)，为了便于观察，将5.5～8.5 ppm部分图谱扩大32倍，其中22种匹配较好的化合物信号峰被一一指出。

对数据进行主成分分析(PCA)，获得了组间差异的大致模型，但是PCA的结果不能明显地将两组分离开，所以建立了偏正交二乘法分析(OPLS-DA)模型(图2)，OPLS-DA模型使两组样本有较好的分离，并且揭示了两组之间的差异代谢物。在OPLS-DA模型中，两组样本有较好的分离(R2Y=0.35，Q2Y=0.563)。通过评估OPLS-DA 得分图的系数和载荷图，得出了两组之间差异较大的代谢物，两组分离出的主要代谢物在表1中体现。共筛选出12种卵巢静止组和健康组有差异的代谢物。由表1可知：卵巢静止组(B组)奶牛相对于发情组(A组)奶牛血浆中乙酸(acetic acid)、柠檬酸(citric acid)和酪氨酸(tyrosine)等3种代谢物含量显著增多，而脂类：低密度脂蛋白(L1：LDL)、极低密度脂蛋白(L2：VLDL)、脂质(L6/L9：Lipid)、丙氨酸(alanine)、丙酮酸(pyruvic acid)、肌酸(creatine)、胆碱(choline)、磷酸胆碱(phosphorylcholine)和甘油磷酸胆碱(glycerophosphoryl choline)9种代谢物含量显著减少。

如图3所示，图中红色和绿色标注的是试验检测到的差异代谢产物，其他的代表该代谢产物的上下游代谢产物，9种代谢产物之间形成一个互作网络，通过甘油磷脂代谢和甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢通路(glycine，serine and threonine metabolism pathway)、三羧酸循环通路(citrate cycle pathway)和甘油磷脂代谢通路(glycerophospholipid metabolism pathway)共同发挥作用。差异代谢产物通路归属结果如表2所示，共9种差异代谢产物在数据库中得以匹配。

表1发情组和卵巢静止组奶牛血浆12种差异代谢产物

Table 112 differential metabolites in plasma of dairy cows with oestrus and ovarian inactivity

a相关系数(r)：正负号分别表示代谢物浓度的正负相关性；P值等于0.05和自由度等于10共同决定差异显著性水平，依以此为基础，相关系数(r)的绝对值大于0.602作为统计分析代谢物的临界值；b峰的多重性：s.单峰；d.双峰；t.三重峰；q.四重峰；dd.双二重峰；m.多重峰；br.广泛的共鸣。“↑”代表上升趋势。“↓”代表下降趋势

aCorrelation coefficients，positive and negative signs indicate positive and negative correlation in the concentrations，respectively；The correlation coefficient of│r│> 0.602 was used as the cutoff value for the statistical significance based on the discrimination significance at the level ofP=0.05 anddf(degree of free-dom) = 10 (A vs.B)；bMultiplicity：s.Singlet；d.Doublet；t.Triplet；q.Quartet；dd.Doublet of doublets；m.Multiplet；br.Broad resonance

表2九种差异代谢产物代谢通路归属

Table 2Metabolic pathways of 9 differential metabolites

NA表示此代谢物在HMDB数据库中未匹配到，HMDB和KEGG两列中的数字分别代表代谢物在其数据库中的身份编号

NA means the metabolite is not matched to HMDB database，and the number in two columns of HMDB and KEGG is respectivey the number (ID) of metabolites in its database

3讨论

本试验应用1H NMR技术筛选卵巢静止奶牛血浆差异代谢产物，结果显示相对于正常发情奶牛，卵巢静止奶牛血浆中共12种代谢产物含量表现异常。这些代谢产物浓度的异常可被归纳为糖代谢异常、氨基酸代谢异常、脂蛋白代谢异常和胆碱代谢异常四类，结合通路分析，对其逐一进行讨论。

3.1糖代谢异常

糖代谢异常包括乙酸、丙酮酸和柠檬酸的代谢异常。丙酮酸本身是一种较弱的有机酸，是动物机体代谢的重要枢纽，承担着糖、脂肪和蛋白质三大物质之间相互转换的任务[9]。乙酸多主要是机体脂肪分解代谢增强，进入肝细胞后代谢成乙酰CoA，消耗肝细胞内ATP[10]，乙酸和丙酮酸生成的乙酰CoA进入三羧酸循环后生成柠檬酸，氧化供能[11]。在三羧酸循环通路中，糖酵解的终产物——丙酮酸，脱羧生成乙酰CoA而后进入此通路，产生柠檬酸；乙酸与乙酰CoA相互转化，从而进入到三羧酸循环通路中，产生柠檬酸。另外，丙酮酸的另一个去路是转换成氨基酸，如丝氨酸和丙氨酸等，从而进入到甘氨酸，丝氨酸和苏氨酸代谢通路[12]。本试验结果显示丙氨酸含量显著减少，说明丙酮酸主要偏向于另一个去路——氧化供能，以满足机体对能量的需要，这提示发生卵巢静止的奶牛需要更多的能量。提示卵巢静止奶牛很可能经历或正处于能量负平衡状态，这与很多文献报道能量负平衡导致奶牛发生卵巢静止的观点相一致[13-15]。

3.2氨基酸代谢异常

氨基酸代谢异常包括丙氨酸代谢异常、肌酐(肌氨酸)代谢异常和酪氨酸代谢异常。丙氨酸是一种非必需氨基酸，通过丙酮酸的转氨基作用转化而成[12]。丙酮酸含量降低，转化得到的丙氨酸含量也会降低，即丙酮酸增加对柠檬酸的生成，而降低了转化的丙氨酸含量。丙氨酸作为一种生糖氨基酸，在卵巢静止奶牛血浆浓度表现出降低趋势，将导致机体糖异生作用减弱，会加剧奶牛能量负平衡[16]。肌酐又叫做肌酸，60%～70%肌酸常以磷酸肌酸形式存在于肌肉中，使肌原纤维产生足够的能量形成肌肉收缩力[17]。本试验结果显示肌酸含量降低，提示卵巢静止奶牛体内肌酸含量下降可能与能量消耗多以供能有关。酪氨酸是一种必需氨基酸，奶牛体内不能合成，必须从体外摄取。根据本试验中酪氨酸含量增加可知，奶牛体内酪氨酸的代谢发生异常，可能利用和转化受阻，导致其在奶牛体内蓄积。而酪氨酸作为一种生酮氨基酸，其在血浆内升高说明生酮过程正常或受阻。酪氨酸利用或代谢受阻的问题值得关注。因为这不仅浪费了日粮酪氨酸，而且提示酪氨酸未发挥应有的作用。

3.3脂蛋白代谢异常

脂蛋白代谢异常包括低密度脂蛋白(LDL)代谢异常、极低密度脂蛋白(VLDL)代谢异常和脂质代谢异常。以往的研究指出：在奶牛发生酮病时，由于得不到足够的葡萄糖，机体将加速动员脂肪和体蛋白来维持能量需要，造成血浆中的LDL和VLDL均降低[18-19]；另外，VLDL是奶牛肝的重要转运蛋白，具有转移甘油三酯的作用，血浆中VLDL的降低说明肝合成VLDL的能力降低。本试验中卵巢静止奶牛血浆中多种脂蛋白的同时降低，意味着奶牛可能发生酮病，并且继发脂肪肝病[20]。这与前面提到的卵巢静止奶牛可能患有酮病，并且更显肥胖的讨论结果相一致，再次证明卵巢静止奶牛的能量负平衡状态。

3.4胆碱代谢异常

胆碱代谢异常包括胆碱、磷酸胆碱和甘油磷酸胆碱的代谢异常。胆碱是一种B族维生素，是合成乙酰胆碱的前体，具有降低血清胆固醇，促进肝脂肪代谢(抗脂肪肝)的作用[21]。胆碱缺乏影响脂肪运输，加速脂肪在肝内蓄积，诱发脂肪肝[22]；在甘油磷脂代谢通路中，磷酸胆碱和甘油磷酸胆碱都可以转化为胆碱；胆碱作为奶牛重要的能源物质，可以通过增高葡萄糖浓度进而提供能量[23]；肌酸作为直接能源物质可以直接为机体供能；网络结果图显示：肌酸和胆碱共同作用于肌氨酸，但是两者的降低并未影响到肌氨酸，一方面说明肌氨酸不是卵巢静止奶牛血液的主要差异代谢物；另一方面说明肌酸和胆碱的代谢异常可能仅为合成代谢异常，并非分解代谢异常，因为分解代谢的产物并未表现异常。这提示，卵巢静止奶牛采食的肌酸和胆碱含量可能不足，或者其体内的肌酸和胆碱合成障碍；但是胆碱和肌酸合成障碍应该只能是个体差异，因为胆碱和肌酸采食量减少这样的情况不可能同时发生在较多奶牛身上，所以得到了“卵巢静止奶牛体内同时调节胆碱和肌酸合成代谢的某种物质或者某种通路发生了变化”的猜想。这一设想在上文中得到验证：胆碱是奶牛体内所有类固醇激素的合成原料，也就是说，胆碱合成障碍将直接导致奶牛体内雌激素(主要是E2)下降，使奶牛无法正常发情。因此，胆碱将是研究奶牛卵巢静止发生机制的重要节点，这需要在今后进一步对调节胆碱和肌酸代谢的代谢网络前段进行查找，以期能够找到发生变化的最终切点，为研究奶牛卵巢静止发生的机制提供新方向。

4结论

应用1H NMR技术成功地筛选出卵巢静止奶牛血浆差异代谢产物；相对于正常发情奶牛，卵巢静止奶牛血浆共12种代谢物表现异常。这些代谢产物浓度的差异体现了卵巢静止奶牛体内多种代谢异常，多种代谢异常提示奶牛卵巢静止与泌乳早期能量负平衡有关，并有伴发酮病和脂肪肝病的风险；另外，卵巢静止奶牛血浆肌酸、胆碱浓度降低和酪氨酸浓度升高的变化，为今后更为深入研究奶牛卵巢静止发生机制提供了新的方向。

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(编辑白永平)

1H-NMR-based Plasma Metabolic Profiling of Postpartum Dairy Cows with Ovarian Inactivity

XU Chu-chu，XIA Cheng*，SUN Yu-hang，XIAO Xin-huan，WANG Gang，SHU Shi，ZHANG Hong-you，XU Chuang，YANG Wei

(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，HeilongjiangBayiAgriculturalUniversity，Daqing163319，China)

Key words:dairy cows；ovarian inactivity；nuclear magnetic resonance technology；plasma differential metabolites

Abstract:To understand the differences in metabolic changes between cows with ovarian inactivity and estrus cows，we selected cows at 60-90 d postpartum，which had similar age，parity，body condition score and milk yield.According to clinical manifestations，B-ultrasound scan，rectal examination and hormone tests，10 cows were assigned to the estrus group (A) and 10 to the ovarian inactivity group (B).All plasma samples were analyzed by1H NMR spectroscopy to compare plasma metabolomic profiles between the groups.We used multivariate pattern recognition，to screen for different metabolites in plasma of anestrus cows.Compared with normal estrous cows，there were abnormalities in 12 kinds of metabolites in postpartum cows with ovarian inactivity，including an increase in acetic acid，citric acid and tyrosine，and a decrease in low-density lipoprotein，very low density lipoprotein，lipids，alanine，pyruvate，creatine，choline，phosphorylcholine and glycerophosphorylcholine.These metabolites were closely related to abnormality of glucose，amino acid，lipoprotein and choline metabolism，which may disturb the normal estrus.The decrease in plasma creatine and the increase in tyrosine were new changes for ovarian inactivity of postpartum cows.In conclusion，a variety of metabolic disorders indicate that ovarian inactivity is related to negative energy balance in early lactation，and has the risk of ketosis and fatty liver.The decrease of creatine and choline concentration and increase of p-hydroxyphenylalanine concentration in cows with ovarian inactivity provide a new direction for research on the mechanism of ovarian inactivity in cows.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.01.026

收稿日期：2015-06-10

基金项目：国家自然基金面上项目(31372488)；国家科技支撑计划课题(2013BAD21B01-2；2012BAD12B05；2013BAD21B00)；黑龙江八一农垦大学研究生创新科研项目(YJSCX2015-Y22)

作者简介：许楚楚(1990-)，女，黑龙江鹤岗人，硕士，主要从事动物营养代谢病的研究，E-mail：cc15845951639@163.com *通信作者：夏成，E-mail：xcwlxyf2014@163.com

中图分类号：S857.22

文献标志码：A

文章编号:0366-6964(2016)01-0190-08