李春晓,张宇曦,祁克宗,韩先干,涂 健,薛 挺,周秀红
(安徽农业大学动物科技学院,合肥 230036)
phoP/Q双组分系统对禽致病性大肠杆菌的毒力调控作用
李春晓,张宇曦,祁克宗*,韩先干,涂健,薛挺,周秀红
(安徽农业大学动物科技学院,合肥 230036)
摘要:phoP/Q作为一种外在环境感受器,参与调节细菌对外部环境的适应性。本研究拟探讨phoP/Q双组分系统对禽致病性大肠杆菌(APEC)的生长、定植、毒力等生物学特性的影响。利用Red重组系统构建APEC AE 17株的phoP/Q双组分调控系统缺失株,并构建phoP/Q双组分调控系统回复质粒,转化缺失株,构建回复株。通过生长运动性试验、黏附入侵CEF细胞试验、毒力基因转录水平检测以及半数致死量(LD50)等试验比较野生株、缺失株、回复株的生物特性。与野生株相比,phoP-phoQ缺失不改变其生长特性;运动性较野生株下降63%;黏附与入侵CEF细胞能力分别降低69.83%(P<0.01)和62.17%(P<0.05);LD50显示毒力减弱13.3倍;polA、tsh基因转录水平分别上调41%、54%;sodA、iss分别下调64%和98%。phoP/Q双组分系统参与对APEC致病性的调控,该系统的缺失会降低APEC的致病性。
关键词:禽致病性大肠杆菌;phoP/Q双组分调控系统;致病性;荧光定量PCR
禽致病性大肠杆菌(avian pathogenicEscherichiacoli,APEC) 属于肠道外致病菌。由于其复杂的血清型和广泛的耐药性,一直制约着APEC疾病的防控,并给养禽业造成重大经济损失[1-2]。影响APEC致病性的毒力因子包括黏附素、溶血素、摄铁系统、脂多糖、侵袭素、毒素等。参与细菌毒力调控的系统主要包括有phoP/Q双组分调控系统、QS系统、Fur系统等。APEC通过调控系统对其毒力因子进行调控,实现对宿主的感染和致病[3]。
phoP/Q是革兰阴性菌中普遍存在的双组分调控系统[4]。它由细菌的细胞质内的反应调节蛋白phoP(response regulator protein)和跨膜的组氨酸蛋白激酶phoQ(histidine protein kinases)组成[5]。研究表明,phoP/Q双组分系统作为一种外在环境感受器,能被多种物质(如Mg2+、Ca2+、防御素等)激活,进而调节靶基因转录水平,从而引起宿主细胞对环境的改变做出适应性的调整(如增强耐酸性的能力、参与上皮细胞侵袭和抗菌肽抗感染等)[6-7]。最近的研究表明,phoP/Q系统参与对多种细菌的毒力调控[8]。在沙门菌中phoP/Q系统存在抵抗宿主抗菌肽作用,维持细菌致病力[6,9]。在鼠疫耶尔森菌中phoP/Q系统调控细菌表达一系列毒力因子,免受巨噬细胞吞噬并耐受宿主防御系统[10]。但phoP/Q基因对APEC毒力因子在发病中的调控尚未见报道[11-12]。因此本试验利用Red重组系统构建禽致病性大肠杆菌AE17中的phoP/Q双组分调控系统缺失株,并利用低拷贝载体pSTV28构建phoP/Q双组分系统回复质粒,转化缺失株内构建回复株,通过比较野生株、缺失株、回复株的生物特性,研究该系统缺失对APEC菌株的生长、定植、毒力等生物学特性的影响,为进一步研究APEC的phoP/Q双组分调控机制提供参考。
1材料与方法
1.1载体、菌株、试剂
禽致病性大肠杆菌AE17株(O2),本实验室保存。限制性内切酶SalⅠ、EcoRⅠ,DNA ligation Kit Ver.2.0,pSTV 28质粒均购自大连TaKaRa有限公司。L-阿拉伯糖购自Sigma公司。大肠埃希菌DH5α、TOP10,质粒小量提取试剂盒均购自天根生化有限公司。SYBR Green PCR Master Mix和反转录试剂盒购于美国Promega公司。DNA-free kit购于Ambion公司。DNA marker、PCR MasterMix,购自北京康为世纪公司。96和6孔细胞板,购自美国Corning公司。TRIzol购自Invitrogen 公司。0.22 μm的无菌滤器,购自美国Millipore公司。
1.2引物设计
根据GenBank(NC_008563.1)公布的APEC O1基因序列、GenBank(KJ632656.1)公布的APEC O2phoP-phoQ基因序列和GenBank (AY048742.1)公布的pKD3质粒序列,分别设计用于扩增phoP-phoQ上、下游序列的两对引物phoPQ-UF/phoPQ-lap-cat-UR和phoPQ-lap-cat-DF/phoPQ-DR,用于扩增氯霉素抗性片段的引物Cat-lap-phoPQ-F/Cat-lap-phoPQ-R,用于鉴定phoP-phoQ双基因缺失株和回复株的3对引物:phoPQ-OF/phoPQ-OR、phoPQ-IF/phoPQ-IR和M13-47/M13-RV-M,以及用于构建phoP-phoQ回复的引物phoPQ-C-EcoRI-F/phoPQ-C-SalI-R。其中phoPQ-lap-cat-UR与Cat-lap-phoPQ-F、Cat-lap-phoPQ-R与Cat-lap-phoPQ-F两对引物5′端均带有用于进行重叠PCR(overlap-PCR)的反向互补20个碱基。引物序列见表1。
1.3缺失打靶片段的构建
分别利用引物phoPQ-UF/phoPQ-lap-Cat-UR、phoPQ-lap-Cat-DF/phoPQ-DR和Cat-lap-phoPQ-F/Cat-lap-phoPQ-R扩增回收得到phoP-phoQ上游同源臂(1 068 bp)、下游同源臂(992 bp)和氯霉素抗性片段(1 033 bp)。再使用overlap-PCR的方法利用引物phoPQ-UF/Cat-lap-phoPQ-R将phoP-phoQ上游同源臂(Up)与氯霉素片段(Cat)连接得到Up-Cat片段。最后再次使用overlap-PCR的方法利用引物phoPQ-UF/phoPQ-DR将Up-Cat片段与phoP-phoQ下游同源臂(Down)连接形成打靶片段Up-Cat-Down。打靶片段回收后,用于转化含有pKD46质粒的AE17菌株进行缺失株的构建。
1.4缺失株的构建及抗性基因的敲除
参照文献[13]的方法制备感受态细胞,利用同源重组方法进行phoP-phoQ基因的敲除 (图1)。取纯化好的Up-Cat-Down打靶片段约500 ng与100 μL感受态细胞混合,冰浴15 min后将混合物转入2 mm的Bio-Rad电转化杯中,用电转仪进行电转化。转化参数设置为电压2.3 kV、电阻200 Ω、脉冲25 μF。电击后迅速加入900 μL SOC培养基,28 ℃振荡培养45 min后涂于LB(Cat+)平板(氯霉素质量浓度为10 μg·mL-1),37 ℃恒温培养12 h,PCR鉴定具有氯霉素抗性的克隆。
表1缺失株和回复株的引物序列
Table 1Primers used in the gene deletion and complemented strains
参照上文电转化步骤,转化pCP20质粒至缺失株中,选择含pCP20质粒的阳性克隆,28 ℃培养8 h后,提高到42 ℃过夜培养,通过温度的转换热诱导FLP重组酶表达,接种固体LB培养基后,挑取单克隆菌落,PCR鉴定氯霉素抗性消除的缺失株AE17ΔphoPQ。
1.5回复株的构建
利用引物phoPQ-C-EcoRI-F/phoPQ-C-SalI-R扩增回收含有上游启动子、下游终止子和phoP-phoQ基因ORF的序列C-phoPQ(2 776 bp)。使用限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ双酶切处理pSTV28质粒和C-phoPQ片段,经T4连接酶连接后,转化入DH5α,使用M13-47/M13-RV-M引物进行PCR鉴定,含有回复质粒pSTV28-C-phoPQ的阳性克隆可扩增出2 924 bp的条带。
同样方法制备缺失株AE17ΔphoPQ的电转化感受态细胞。将构建好的回复质粒pSTV28-C-phoPQ电转化入缺失株AE17ΔphoPQ中,将PCR鉴定的阳性回复株命名为AE17CΔphoPQ。
1.6生长曲线及运动性测定
参照文献[14]的方法测定野生株、缺失株和回复株的生长曲线。参照文献[15]的方法配制泳动(swiming)培养基(1% trytone,0.5% NaCl,0.8% glucose,0.3% agar)和进行运动性测定:取生长至OD600 nm=1.0的野生株AE17、缺失株AE17ΔphoPQ和回复株AE17CΔphoPQ各10 μL滴于平板中间,37 ℃恒温培养12 h,观察并测量菌落直径的差异。
1.7细胞的黏附和入侵
将野生株、缺失株、回复株,37 ℃培养至对数期,6 000 g 4 ℃离心5 min,弃上清,菌体用无菌PBS洗涤3次,并用无抗生素的DMEM重悬。将液氮中保存的原代CEF细胞经10%胎牛血清DMEM完全培养液于25 mL细胞培养瓶中培养复苏后,传代于24孔细胞培养板中,置于含5% CO2细胞培养箱中37 ℃培养,当细胞长满孔底时,以细胞专用PBS洗涤细胞3次后待用。
参照文献[16],设计黏附组和入侵组每组都包含上述处理的三株细菌,按感染复数(MOI)=200加入满CEF细胞的24孔板中,对照组加入等体积的不含抗生素的DMEM,每孔做三个重复。400 g低速离心5 min,使细菌沉降至孔底与细胞充分结合,37 ℃恒温静置孵育1.5 h,无菌PBS洗5次。黏附组每孔加入0.1%胰酶 200 μL,室温作用10 min,裂解细胞,稀释后涂布LB平板,37 ℃培养后平板菌落计数进行细菌计数。入侵组每孔加入含100 μg·mL-1庆大霉素的DMEM作用1 h,无菌PBS洗3次后,用0.5% Triton X-100裂解细胞,稀释后涂布LB平板,37 ℃培养后平板菌落计数法进行细菌计数。
1.8荧光定量PCR比较野生株和缺失株毒力基因转录水平差异
参照文献[17]的方法用TRIzol法提取野生、缺失和回复株的RNA。设计禽致病性大肠杆菌毒力基因[18]——pfs、vat、luxS、tsh、fuyA、iucD、iss、yhiD、SodA、metJ、polA以及管家基因dnaE的荧光定量PCR引物[16]。引物均由上海英骏生物技术有限公司合成,见表2。荧光定量PCR反应体系为20 μL:Real time PCR Master Mix 10 μL,Primer 1(10 μmoL·L-1) 0.5 μL,Primer 2(10 μmoL·L-1) 0.5 μL,模板1 μL,ddH2O 8 μL。扩增条件:50 ℃×2 min,95℃×10 min;变性95 ℃×15 s,60 ℃×1 min,循环次数40次。数据分析采用2-ΔΔCT(Livak)法[19],用于比较野生株和缺失株毒力基因转录水平差异。
表2Q-PCR所用的引物序列
Table 2Q-PCR primers used in this study
1.9半数致死量(LD50)的测定
将野生株、缺失株、回复株,37 ℃培养至对数期,PBS洗涤后重悬。对10日龄樱桃谷鸭采用腿部肌肉注射的方式进行攻毒,分为6组,每组8只,攻毒剂量如下:1×109、1×108、1×107、1×106、1×105和1×104。攻毒后连续观察7 d,记录发病死亡情况并采用改良寇氏法计算半数致死量(LD50)。
2结果
2.1phoP-phoQ缺失株和回复株的鉴定
对疑似缺失株和回复株用外侧引物phoPQ-OF/phoPQ-OR进行PCR鉴定,结果表明,缺失株和回复株可扩增出2 435 bp的片段(图2A泳道1、2),而野生株扩增的片段大小为4 432 bp(图2A泳道3)。对疑似缺失株和回复株用内侧引物phoPQ-IF/phoPQ-IR进行PCR鉴定,结果表明,缺失株未扩增出条带(图2B泳道5),而回复株和野生株扩增出大小为711 bp的片段(图2B泳道6、7)。鉴定结果表明,成功获得AE17ΔphoPQ缺失株和AE17CΔphoPQ回复株。
2.2生长曲线及运动性检测
对野生株、phoP-phoQ缺失株及回复株的生长曲线和运动性检测结果(图3、4)表明,phoP-phoQ双基因缺失后对细菌的生长速率没有明显影响,但运动性显著降低,仅为野生株的37%(P<0.01),而AE17CΔphoPQ回复株可恢复其运动性。
2.3phoP-phoQ缺失显著降低AE17对CEF细胞的黏附和入侵
对野生株AE17、缺失株AE17ΔphoPQ和回复株AE17CΔphoPQ对CEF细胞的黏附和入侵检测结果表明,AE17、AE17ΔphoPQ菌株对CEF细胞的黏附能力分别为3.47×104、1.05×104CFU·孔-1;入侵能力分别为1.19×103、4.50×102CFU·孔-1。与野生株相比,缺失株对CEF的黏附和入侵能力分别降至30.17%和37.83%,敲除株黏附及入侵CEF能力较AE17均显著的下降(P<0.05)。回复株可以恢复对CEF的黏附能力,回复株对CEF的入侵能力能够部分恢复(图5)。
2.4相关毒力基因 mRNA 水平转录情况
对野生株AE17、缺失株AE17ΔphoPQ和回复株AE17CΔphoPQ部分的毒力基因的mRNA转录分析显示:phoP-phoQ双基因缺失后polA和tsh基因转录水平分别上调41%和54%,而sodA和iss分别下调了64%和98%,其他基因的转录水平变化不明显(图6)。
2.5半数致死量(LD50)的测定
动物试验结果显示AE17、AE17ΔphoPQ、AE17CΔphoPQ对雏鸭的LD50分别为1.78×105、2.37×106和4.22×105CFU,表明phoP-phoQ双基因缺失可导致APEC对樱桃谷鸭的致病力减弱13.3倍(表3)。
表3phoP-phoQ基因缺失对APEC致病性(LD50)的影响
Table 3The effects of phoP-phoQ deletion mutant on LD50of APEC
3讨论
革兰阴性菌中phoP/Q双组分系统即为一种外在环境感受器,参与调节细菌对外部环境的适应性[20]。有研究推测革兰阴性菌的phoP-phoQ作用机制可能是调节细菌外膜蛋白以及LPS结构,使其能与宿主抗菌肽结合,减小了宿主抗菌肽从细菌表面竞争二价金属离子的量或作用强度,进而减弱宿主清除细菌的能力,维持细菌致病力[9-10,21]。
本研究结果表明,缺失株AE17ΔphoPQ在生长曲线上较野生株并没有明显变化,而运动性较野生株下降了63%,这与C.J.Alteri等报道的phoP缺失株运动性增强相反[22]。推测phoP和phoQ可能对细菌的群集运动都有显著的调控影响,phoP单缺失会造成细菌运动能力增强,而phoP/Q双组分全部缺失会造成细菌运动能力降低[23],但其具体机制仍有待进一步研究。
细菌黏附于宿主细胞或其他机体表面对细菌的定殖、感染至关重要[24-25]。APEC在自然条件下一般先在禽类的呼吸道表面定殖,继而感染肺部,然后才进入血液并进行扩散,导致机体发病。为了验证phoP/Q双组分系统对APEC定植感染能力的影响,本试验对phoP-phoQ缺失前后APEC黏附和入侵CEF细胞能力以及对禽类的LD50进行检测。结果显示缺失株的黏附及入侵能力均较野生株下降明显(P<0.05),LD50也较野生株下降了13.3倍,而回复株毒力与基因的表达有关,而基因的表达与之相连载体的表达有关,所以回复株毒力与原始株相比有所降低,但恢复大部分感染及致病能力。结果表明phoP/Q双组分系统对APEC致病性具有重要调控作用。这与其他细菌中相关研究类似,phoP/Q双组分系统的缺失能降低细菌对宿主的致病性,在福氏志贺菌中phoP/Q双组分的突变降低了其对PMNs (多形核白细胞)和抗菌肽的抵抗能力,进而降低其致病性[26]。
phoP/Q双组分系统中,组氨酸蛋白激酶phoQ通过感受外界信息变化激活phoP蛋白;反应调控蛋白phoP通过调节细胞内H+的外排,产生质子动力来调控下游基因的表达[22]。本研究对pfs、vat、luxS、tsh、fuyA、iucD、iss、yhiD、SodA、metJ和polA等基因的转录水平进行检测,在phoP-phoQ缺失后APEC的polA(DNA修复相关)、tsh(黏附相关)基因转录水平均显著上调(P<0.05);sodA(超氧化酶)、iss(血清存活)的转录水平均极显著下调(P<0.01)。结果表明phoP/Q双组分系统可能参与多种APEC毒力基因的调控,影响APEC对宿主的致病性。
iss与tsh是APEC的关键致病基因,对其毒力影响显著[27-28]。phoP-phoQ双基因缺失前后对比,iss转录水平下调了98%,这可能造成在腿部肌肉攻毒后细菌在体内的血清存活能力下降明显;尽管tsh转录上调了0.54倍,但缺失株毒力仍然下降13.3倍。这与在沙门菌上,phoP/Q任意一基因的敲除会造成其不同毒力因子转录升高或者下降,但细菌毒力下降一致[29]。黏附因子tsh在缺失株中转录水平上调,而缺失株黏附DEF细胞能力却降低,可能是由于细菌中存在多种不同的黏附素[24,30],tsh只是其中之一。此外,细菌对细胞的入侵黏附是个多因子共同作用的过程。本研究中,polA和sodA转录的改变,其原因可能与在沙门菌中一样,是由于phoP/Q的缺失,导致细菌丧失对跨膜电化学梯度的调控,进而引起电化学梯度敏感性基因转录水平的改变[22]。
4结论
phoP/Q双组分系统对APEC的致病性具有重要调控作用,phoP-phoQ双基因的缺失会造成APEC致病性明显减弱。本研究为进一步开展phoP/Q双组分系统对APEC的致病作用的探讨提供参考。
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(编辑白永平)
The Role of phoP/Q Two-component System in Virulence of Avian PathogenicEscherichiacoli
LI Chun-xiao,ZHANG Yu-xi,QI Ke-zong*,HAN Xian-gan,TU Jian,XUE Ting,ZHOU Xiu-hong
(CollegeofAnimalScienceandTechnology,AnhuiAgriculturalUniversity,Hefei230036,China)
Key words:avian pathogenicEscherichiacoli;phoP/Q two-component system;pathogenicity;real-time PCR
Abstract:As a kind of external environment receptor,phoP/phoQ is involved in regulating bacterial adaptability to external environment.The aim of this study was to investigate the effect of phoP/Q two-component system to biological characteristics of avian pathogenicEscherichiacoli(APEC) such as growth,engraftment,and virulence.The phoP-phoQ deletion mutant strain was constructed by homologous recombination assay,and the complement strain was constructed through transformation deletion strain with the plasmid complement.The growth curve determination and motility assay,the adhesion and invasion to chicken embryo fibroblast (CEF),detection of virulence gene transcription and median lethal dose (LD50) experimental were used to compare biological characteristics of wild strain,deletion strain and complement strain.Compared with the wild strain,the growth characteristics of the mutant strain did not change;the motility of the mutant strain felled by 63% comparing with wild strain;its ability of adhesion and invasion to DEF cells respectively decreased to 69.83% and 62.17%;and LD50was significantly reduced by 13.3 times.The transcription ofpolA,tshrespectively increased by 41% and 54%,while thesodAandissdecreased by 64% and 98%.The phoP/Q two-component system is involved in the regulation of the APEC pathogenic,and its deletion can reduce the pathogenicity of APEC.
doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.01.021
收稿日期:2015-06-29
基金项目:国家自然科学基金项目(31372402);安徽省自然科学基金(1508085SQC206)
作者简介:李春晓(1990-),女,河南驻马店人,硕士生,主要从事兽医疫病病理研究,E-mail:18756903021@163.com *通信作者:祁克宗(1962-),男,安徽合肥人,教授,硕士生导师,主要从事兽医疫病病理研究,E-mail:qkz@ahau.edu.cn
中图分类号:S852.612
文献标志码:A
文章编号:0366-6964(2016)01-0157-08