1型鸭甲肝病毒VP3蛋白的抗血清中和活性分析及B细胞表位鉴定

沈友林，汪铭书 *，程安春，贾仁勇，朱德康，陈　舜，刘马峰，刘　菲，杨　乔，孙昆峰，陈孝跃

(1.四川农业大学动物医学院禽病防治研究中心，成都 611130；2.四川农业大学预防兽医研究所，成都 611130；3.动物疫病与人类健康四川省重点实验室，成都 611130)



1型鸭甲肝病毒VP3蛋白的抗血清中和活性分析及B细胞表位鉴定

沈友林1，2，3，汪铭书1，2，3 *，程安春1，2，3，贾仁勇1，2，3，朱德康1，3，陈舜1，2，3，刘马峰1，2，3，刘菲3，杨乔1，2，3，孙昆峰1，2，3，陈孝跃1，3

(1.四川农业大学动物医学院禽病防治研究中心，成都 611130；2.四川农业大学预防兽医研究所，成都 611130；3.动物疫病与人类健康四川省重点实验室，成都 611130)

摘要：旨在探究1型鸭甲肝病毒(DHAV-1)VP3蛋白抗血清的中和活性并鉴定VP3的线性B细胞表位。利用pGEX-4T-1表达载体，在BL21(DE3)宿主菌中原核表达DHAV-1VP3基因，以切胶纯化出的蛋白质为抗原免疫兔制备多克隆抗体，通过鸡胚中和试验对多抗的中和效价进行检测；采用Karplus&Schulz、Emini、Jameson-Wolf和Parker方法分别对柔韧性、表面可及性、抗原性及亲水性进行分析，得到了4条候选线性B细胞表位，以制备的兔抗VP3多克隆抗体为一抗，通过间接ELISA方法对人工合成的B细胞表位进行鉴定，并进一步用临床鸭血清样品对鉴定的B细胞表位的抗体检测能力进行评估。结果显示，VP3在BL21(DE3)中以包涵体形式表达，大小约54 ku，Western blot分析表明重组蛋白质具有较好的反应原性。制备的兔抗VP3多克隆抗体的琼扩效价达到1∶16，并能中和DHAV-1，中和效价为1∶39；利用间接ELISA鉴定出GKRKPCRRPIHKPKNPPQEP(1—20 aa)、FNTGRYQMSWYPIADGEQSL(131—150 aa)和VNSSAPSNID(200—209 aa)为VP3的B细胞表位，抗体检测能力试验结果显示表位肽可检测临床DHAV-1鸭血清。本研究表明DHAV-1 VP3的抗血清具备一定的中和活性，1—20 aa、131—150 aa和200 —209 aa为VP3的B细胞表位且具有临床应用前景。

关键词：1型鸭甲肝病毒；VP3蛋白；多克隆抗体；中和活性；B细胞表位

鸭病毒性肝炎(duck viral hepatitis，DVH)是一种发病快、传播迅速、高度接触性和高死亡率的重要传染病，它主要感染4周龄以下雏鸭，以肝肿大、出血为主要病变特征，严重制约着养鸭业的健康发展。引起DVH的病毒至少有3种，其中鸭甲肝病毒1型(duck hepatitis A virus type 1，DHAV-1)和新型鸭肝炎病毒(DHAV-2和DHAV-3)分别为鸭甲型肝炎病毒(DHAV)的三种基因型[1]，均为小RNA病毒科禽肝炎病毒属成员[2]，而鸭肝炎病毒2型(duck hepatitis virus 2，DHV-2)和3型(DHV-3)已经归为星状病毒科[3]。DHAV-1所致的鸭肝炎是分布最广，危害最大的，1周龄内死亡率可超过50%，甚至达到95%[4]。

DHAV-1为单股正链小RNA病毒，由RNA和衣壳组成，没有囊膜。基因组只有一个开放阅读框(open reading frame，ORF)，上下游分别连接5′非编码区(5′ UTR)和3′非编码区(3′ UTR)。基因组编码的2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D七种非结构蛋白在病毒的复制和增殖中发挥作用；编码的VP0(VP4和VP2共价相连)、VP3和VP1三种结构蛋白组装形成衣壳，其中VP1和VP3位于衣壳表面，彼此空间结构非常相似。序列比对发现，VP1有很多高度变异的区段[5]，这些区域大多暴露在外，使VP1成为主要的抗原蛋白[6]，而VP3的N端也有一段暴露的高变氨基酸序列[7]，提示VP3也有可能是决定抗原性的主要蛋白质之一，有研究证明VP3具有抗原性[8-9]。然而，VP3的抗血清是否具有中和活性以及VP3蛋白的B细胞表位鉴定还未见报道。

作者用原核表达的VP3蛋白制备多克隆抗体，并对其抗体效价及中和活性进行分析，同时利用生物信息学工具，综合分析获得VP3可能存在的线性B细胞表位，以制备的多克隆抗体通过间接ELISA鉴定VP3蛋白的B细胞表位，这对了解VP3的抗原结构和免疫学活性，开发DHAV-1新型诊断试剂和疫苗都具有重要意义。

1材料与方法

1.1实验材料及动物

DHAV-1 H株病毒、DHAV-1鸡胚化弱毒株(CH60株)、DH5α、BL21(DE3)和pGEX-4T-1载体均由笔者所在实验室保存和提供；T克隆载体pMD19-T(Simple) 购自宝生物工程(大连)有限公司。RNAiso Plus、2×PrimeStar Max Premix、DNA Maker、DNA Ligase Mix、限制性内切酶(BamHⅠ、XhoⅠ)均购自宝生物工程(大连)有限公司；HRP标记的山羊抗兔IgG抗体购自北京中杉金桥；HRP标记的兔抗鸭IgG抗体购自北京康碧泉，兔抗DHAV-1 IgG由本实验室制备保存。临床鸭血清样(可能含DHAV-1阳性或阴性血清)采自各地养殖场；2～3 kg健康雄兔、9日龄鸡胚购自本地养殖场。

1.2引物设计与合成

根据GenBank公布的DHAV-1 H株(JQ301467)基因序列，利用Primer Premier 5和Oligo 7软件设计一对可以扩增覆盖VP3基因全长的特异性引物，上游引物 VP3F：5′-GGATCCGCAATGGACAATCAGGGAAAGAGA-3′(下划线所示为BamHⅠ位点)，下游引物 VP3R：5′-CTCGAGAACTGGCTAATCATCCCCTA-3′(下划线所示为XhoⅠ位点)，预期目的片段长度774 bp。引物由Invitrogen(上海)公司合成。

1.3VP3的表达、纯化及反应原性分析

按RNAiso Plus试剂的说明书提取病毒RNA，反转录成cDNA后进行PCR扩增，胶回收目的片段并T-A克隆至pMD19(Simple)载体，PCR和酶切鉴定正确后命名为pMD-VP3。BamHⅠ和XhoⅠ分别酶切pMD-VP3和pGEX-4T-1载体，胶回收目的片段并连接，转化DH5α，鉴定的阳性菌送Invitrogen(上海)公司测序，阳性质粒命名为pGEX-VP3。将pGEX-VP3转化BL21(DE3)并表达，冰浴超声破碎菌体后离心，分别收集上清和沉淀进行SDS-PAGE检测。对IPTG浓度、诱导温度和时间进行摸索并以最优表达条件大量诱导表达。对纯化方式进行摸索，选择切胶方式并参考文献纯化目的蛋白质[10]。重组蛋白质经SDS-PAGE后转移至PVDF膜，以兔抗DHAV-1 IgG(1∶100) 作为一抗，阴性兔血清作为对照，HRP标记的羊抗兔IgG(1∶3 000)作为二抗，按常规方法进行Western blot检测。

1.4兔抗VP3多克隆抗体的制备

将切胶纯化的目的蛋白与等量弗氏佐剂混合并乳化，按常规程序免疫兔(除二免、三免分别免疫1 mg·只-1和0.7 mg·只-1外，其余0.5 mg·只-1)；分离血清，琼扩试验检测多抗效价。以重组蛋白质作为抗原，制备的多抗(1∶100)作为一抗，HRP标记的羊抗兔IgG(1∶3 000) 作为二抗，Western blot检测VP3多抗的反应性。

1.5VP3抗血清的中和活性分析

首先以CH60株(10-4～10-8稀释)接种9日龄鸡胚尿囊腔，常规方法测定ELD50，然后采用“固定病毒-稀释血清”法检测中和效价，具体如下：将多抗在56 ℃处理30 min后进行1∶2～1∶256稀释，然后将200 ELD50的CH60株病毒液与各稀释度的多抗血清等体积混合，37 ℃作用1 h进行中和。将中和液接种9日龄鸡胚尿囊腔，每个稀释度5枚，0.2 mL·枚-1，37 ℃继续孵育，同时设空白对照(用灭菌生理盐水替代中和液，如上步骤操作，鸡胚须全部健活)和病毒对照(接种100 EID50·0.2 mL-1的CH60株，鸡胚须全部死亡)。连续观察5 d，记录死亡情况，Reed-Muench法计算结果。

1.6VP3的B细胞表位鉴定

1.6.1B细胞表位的预测与合成登录免疫信息学网站(http：//tools.immuneepitope.org)，采用Karplus&Schulz、Emini及Parker方法分别对VP3蛋白序列的柔韧性、表面可及性和亲水性进行分析。进一步结合DNAStar 7.1的Protean程序，利用Jameson-Wolf法预测抗原性，综合各因素预测得到VP3蛋白的线性B细胞表位。将上述多肽序列送吉尔生化(上海)公司合成，纯度>95%。

1.6.2VP3蛋白B细胞表位的鉴定首先用纯化的VP3重组蛋白质(1∶20～1∶2 560稀释)作抗原包被酶标板，100 μL·孔-1，4 ℃过夜；次日洗板4次，每次5 min，拍干反应板(洗板过程下同)；每孔加入200 μL 1%明胶溶液，37 ℃封闭90 min；弃封闭液，洗板，拍干后100 μL·孔-1加入VP3多克隆血清和阴性血清(分别作1∶80～1∶5 120稀释)，37 ℃孵育90 min；洗板，拍干，加入1∶3 000稀释的HRP-羊抗兔IgG，100 μL·孔-1，37 ℃孵育45 min；洗板，拍干，100 μL·孔-1加入TMB工作液，室温避光作用10 min后，50 μL·孔-1加入2 mol·L-1H2SO4终止反应，用酶标仪以450 nm和630 nm双波长测定OD值。选择阳性孔的OD值1.0左右、阴性对照的OD值0.1左右的稀释度作为最佳抗原工作浓度。

以最佳抗原浓度稀释各表位肽，兔抗VP3多克隆抗体作为一抗(1∶20～1∶2 560稀释)并平行设置阴性血清对照，HRP-羊抗兔IgG(1∶3 000)作为二抗，按上述条件进行间接ELISA，做3个重复，450 nm和630 nm双波长读数。

1.7B细胞表位在检测应用中的初步评估

分别以VP3a单肽、VP3a+VP3b+VP3c混合肽和纯化的VP3蛋白作抗原，200 ng·孔-1包被酶标板；取10份临床鸭血清样作1∶40稀释，设立阴性鸭血清对照；以HRP标记的兔抗鸭IgG(1∶1 000)作为二抗，参照“1.6.2”的步骤进行检测。

2结果

2.1VP3目的基因的克隆与鉴定

对提取的病毒RNA进行RT-PCR扩增，结果在约750 bp处得到了预期大小的条带(图1A)，先后克隆至pMD19-T(Simple)载体和pGEX-4T-1表达载体，经菌液PCR和酶切鉴定得到预期大小的条带(图1B)。送Invitrogen(上海)测序，对测序结果进行核苷酸序列比对，结果显示载体中插入的基因片段大小为774 bp，并与原始片段相似性为100%，表明重组表达载体构建成功，命名为pGEX-VP3。

2.2重组VP3蛋白的表达、纯化及反应原性分析

SDS-PAGE结果表明，重组VP3蛋白在阳性重组表达菌中得到表达(图2A)，大小约54 ku，符合预期。表达条件优化结果显示，以0.2 mmol·L-1IPTG、37 ℃诱导8 h时表达量最大，且以包涵体形式存在。切胶纯化得到的目的蛋白质纯度较高(图2B)。重组VP3蛋白能与兔抗DHAV-1 IgG特异性结合，具有良好的反应原性(图2C)。

2.3多克隆抗体的制备

经过五免后的兔血清琼扩效价均达到1∶16，对分离的血清进行Western blot分析，结果显示制备的兔抗VP3多克隆抗能与重组VP3蛋白发生结合，产生特异性印记，与兔阴性血清则不能结合(图3)。

2.4VP3抗血清的中和活性分析

通过Reed-Muench法计算该批CH60病毒液的ELD50为10-7.3·0.2 mL-1。用测过ELD50的病毒液，以“固定病毒-稀释血清”法进行鸡胚中和试验，Reed-Muench法计算其中和效价为1∶39，即1∶39的血清可保护50%鸡胚不发生死亡。

2.5VP3蛋白B细胞表位的鉴定

2.5.1B细胞表位预测综合生物信息学软件分析VP3蛋白序列的柔韧性(图4A)、表面可及性(图4B)、亲水性(图4C)和抗原性(图4D)，确定了VP3蛋白可能的4条B细胞表位序列：VP3a(1GK-RKPCRRPIHKPKNPPQEP20)、VP3b(131FNTGR-YQMSWYPIADGEQSL150)、VP3c(177TTWRKST-RDPYG188)和VP3d(200VNSSAPSNID209)。由吉尔生化(上海)人工合成表位肽段。

2.5.2B细胞表位鉴定按照方阵法，确定了最佳抗原工作质量浓度为 0.174 ng·μL-1(1∶1 280稀释)。以该质量浓度包被各表位肽，以阴性血清组作为对照，进行间接ELISA检测，结果表明VP3a(1GKRKPCRRPIHKPKNPPQEP20)、VP3b(131FNTGRYQMSWYPIADGEQSL150)和 VP3d(200VNSSAPSNID209)能与VP3多抗特异性结合，为VP3蛋白的B细胞表位(图5)。

2.6B细胞表位检测应用潜力的初步评估

通过检测10份临床鸭血清，结果发现VP3a单肽及VP3a+VP3b+VP3d混合肽与VP3蛋白一样，可以区分不同DHAV-1抗体水平的鸭血清，而且对于检测结果反映的抗体水平高低的规律，三者是一致的。但VP3a单肽和VP3a+VP3b+VP3d混合肽分别作抗原的间接ELISA检测值(以下分别简称VP3a的值和混合肽的值)显著低于VP3全蛋白作抗原的间接ELISA检测值，VP3a的值与混合肽的值之间没有显著差异(图6)。

3讨论

目前对DHAV的研究主要集中于VP1蛋白[11-15]，它是公认的小RNA病毒最主要的抗原蛋白，对开发亚单位疫苗有重要意义。然而，VP3也是重要的衣壳蛋白，和VP1一样位于病毒衣壳表面，其他小RNA病毒的研究表明VP3上存在大量B细胞和T细胞表位[16-17]，对抗原性有重要影响，但DHAV VP3的相关研究未见报道。

本研究表达的重组VP3蛋白能与兔抗DHAV-1抗体特异性结合，证明了其良好的反应原性。虽然VP3蛋白的反应原性已经被大量研究证实[8-9，18]，但其是否具有免疫原性以及其抗血清是否具有中和活性还不清楚，而中和活性是评价免疫保护力，进而评价疫苗潜力的重要指标，对其研究具有重要意义。对于小RNA病毒的VP3蛋白，目前只有禽脑脊髓炎病毒(avian encephalomyelitis virus)的VP3被证明是有免疫原性的[19]。本研究通过鸡胚中和试验初步证明由DHAV-1 VP3激发机体所产生的抗体能够中和DHAV-1，表明VP3具备开发亚单位疫苗的潜力。

B细胞表位是位于抗原蛋白上能够被机体B淋巴细胞特异性识别的氨基酸序列，有线性和构象型之分，是体液免疫的直接诱因，对B细胞表位的鉴定有利于揭示体液免疫的本质，开发新型诊断试剂和安全、高效的表位疫苗。目前对线性B细胞表位的研究主要有单克隆抗体技术、噬菌体展示技术、裂解法、交互重叠多肽法、肽芯片高通量扫瞄法等[20]，随着生物信息学的发展，通过计算机软件预测线性B细胞表位成为简便、可靠的方法。本研究利用生物信息学软件综合分析，并通过间接ELISA方法检测表明，1—20 aa、131—150 aa和200—209 aa能与兔抗VP3多抗产生免疫结合反应。1—20 aa和177—188 aa是之前预测的DHAV-1 VP3的B细胞表位[8-9]，与DHAV-1亲缘关系最近的人类双埃柯病毒(human parechoviruses)VP3的N端有一段暴露的碱性氨基酸富含区域，被证明是B细胞表位[21]，而DHAV-1的VP3在N端也有同样的结构特征[5]，暗示其也可能是B细胞表位，本研究对1—20 aa的鉴定证明了上述推测；然而177—188 aa在本研究中未得到验证，有可能预测的表位并非真实的B细胞表位，也可能它是隐蔽性表位。为了评估VP3蛋白B细胞表位在检测应用中的潜力，以鉴定出的B细胞表位肽和VP3蛋白分别作抗原，用间接ELISA检测了10份临床鸭血清样本，结果发现表位肽与VP3重组蛋白质一样可区分不同DHAV-1抗体水平的鸭血清，而VP3能用以检测DHAV-1抗体[22]，这表明表位肽同样具有检测DHAV-1抗体的潜力。本研究中，尽管表位肽也能识别DHAV-1血清，但反应原性不及VP3重组蛋白质强，可能是因为本研究中采用的是经优化后的VP3重组蛋白质的间接ELISA检测条件，没有另对表位肽检测DHAV-1抗体的条件进行优化；也有可能是表位肽相对分子质量太小，包被时未能很好地吸附到ELISA板上；还有可能VP3上包含了比本研究中更多的B细胞表位，这需要进一步研究确认。这也提示我们对DHAV表位诊断试剂及疫苗的研究需考虑多表位重叠或偶联载体等技术手段。由于目前尚无对DHAV VP3蛋白B细胞表位鉴定的报道，也没有商品化的DHAV单克隆抗体，因此本试验以自制的兔抗VP3多克隆抗体为材料，采用间接ELISA方法鉴定B细胞表位，结果显示该方法是切实可行的。本研究为深入研究DHAV-1 VP3的抗原结构和免疫学功能提供了重要材料，并为今后DHAV-1新型诊断试剂和新型疫苗的研制带来启发。

4结论

制备的兔抗VP3多克隆抗体具有一定的中和活性，1—20 aa、131—150 aa和200—209 aa为VP3蛋白的线性B细胞表位，初步证明VP3蛋白的B细胞表位具有检测DHAV-1抗体的潜力。

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(编辑白永平)

Neutralizing Activity Analysis of VP3 Antiserums and B-cell Epitopes Identification of VP3 Protein form Duck Hepatitis A Virus Type 1

SHEN You-lin1，2，3，WANG Ming-shu1，2，3*，CHENG An-chun1，2，3，JIA Ren-yong1，2，3，ZHU De-kang1，3，CHEN Shun1，2，3，LIU Ma-feng1，2，3，LIU Fei3，YANG Qiao1，2，3，SUN Kun-feng1，2，3，CHEN Xiao-yue1，3

(1.AvianDiseaseResearchCenter，CollegeofVeterinaryMedicine，SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu611130，China；2.PreventiveVeterinaryInstitute，SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu611130，China；3.KeyLaboratoryofAnimalDiseaseandHumanHealthofSichuanProvince，Chengdu611130，China)

Key words:duck hepatitis A virus type 1；VP3 protein；polyclonal antibodies；neutralizing activity；B-cell epitopes

Abstract:This study aimed at researching neutralizing activity of VP3 antiserums and determining B-cell epitopes of VP3 protein from duck hepatitis A virus type 1(DHAV-1).The pGEX-4T-1 expression plasmid was used to expressVP3 gene of DHAV-1 inE.coliBL21(DE3).The expressed recombinant VP3 protein was purified by gel extraction and was used as immunogen to rabbit to prepare polyclonal antibodies.Chicken embryo neutralization test was conducted to detect the neutralizing titer of polyclonal antibodies.Moreover，Karplus&Schulz，Emini，Jameson-Wolf and Parker method were used to analyze the flexibility，surface accessibility，antigenicity and hydrophilicity of the VP3 protein，respectively.This contributed to obtain four probable B-cell epitopes for VP3 protein.The rabbit anti-VP3 polyclonal antibody was used as the first antibody of indirect ELISA to identity the synthetic peptides.Furthermore，a panel of clinical duck serum samples was used to evaluate capacity of the identified B-cell epitopes for antibodies detection.The results showed that the recombinant VP3 protein was expressed as inclusion body inE.coliBL21(DE3) with a molecular weight about 54 kD，and proved to be with good reactogenicity by Western blot analysis.The prepared polyclonal antibodies reached an titer of 1∶16 by AGP test，it could neutralize DHAV-1 and reached a titer of 1∶39.Furthermore，the B-cell epitopes identified by indirect ELISA were GKRKPCRRPIHKPKNPPQEP(1-20 aa)，FNTGRYQMSWYPIADGEQSL(131-150 aa) and VNSSAPSNID(200-209 aa).The test for antibody detection ability revealed the epitopes were capable of detecting clinical duck antiserums of DHAV-1.This study proved antiserums to VP3 protein of DHAV-1 with neutralizing activity and identified VP3’s three promising B-cell epitopes，1-20 aa，131-150 aa and 200-209 aa，for clinical use.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.01.019

收稿日期：2015-04-24

基金项目：国家“十二五”科技支撑计划(2015BAD12B05)；国家现代农业(水禽)产业技术体系专项(CARS-43-8)；四川省创新团队项目(12TD005/2013TD0015)

作者简介：沈友林(1989-)，男，湖北当阳人，硕士，主要从事禽病学研究，E-mail：youlin_5151luck@sina.com *通信作者：汪铭书，E-mail：mshwang@163.com

中图分类号：S858.325.3；S852.659.6

文献标志码：A

文章编号:0366-6964(2016)01-0141-08