细胞传代致弱的鹅细小病毒YG毒株致病性变化的研究

邵周伍林，李晨曦，刘　明，张青山，张　云

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 兽医生物技术国家重点实验室，哈尔滨 150001)



细胞传代致弱的鹅细小病毒YG毒株致病性变化的研究

邵周伍林，李晨曦，刘明，张青山，张云*

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 兽医生物技术国家重点实验室，哈尔滨 150001)

摘要：旨在观察细胞传代致弱的鹅细小病毒YG毒株对易感雏鹅的致病性变化。将鹅细小病毒(GPV)YG株在鹅胚成纤维细胞(GEF)和鸭胚成纤维细胞(DEF)上进行交替传代培养，病毒在细胞上传至第12代时，开始出现细胞病变；间接免疫荧光试验(IFA)检测发现，随着病毒感染时间的延长，感染细胞数量呈现先增加随后减少的变化趋势，感染后96 h阳性细胞数量最多；病毒的滴度随着传代次数的增加而逐渐升高；当病毒传至第50代时，细胞适应毒株毒价为106.5TCID50·mL-1；雏鹅致病性试验结果显示，第50代病毒毒力明显减弱。细胞传代致弱的GPV YG株所感染雏鹅死亡和发病率降低，且死亡雏鹅无鹅细小病毒病的特征性病变及临床表现。

关键词：鹅细小病毒；病毒致弱；细胞适应；致病性

鹅细小病毒(goose parvovirus，GPV)属于细小病毒科(Parvoviridate)，细小病毒属(ParvovirusGenus)成员。鹅细小病毒为单股线性DNA病毒，病毒粒子直径20～22 nm，无囊膜，呈二十面体对称[1]。鹅细小病毒病也称“小鹅瘟”，是一种主要感染1月龄以内雏鹅和雏番鸭的高发病率、高死亡率的高度接触性传染病[2]。患病雏鹅剖检可见小肠呈卡他性或纤维素性坏死性炎症变化，小肠中下端肠黏膜呈坏死性脱落，并与纤维素性渗出物形成栓塞[3]。该病自1961年在我国首次发现以来，在全国广泛蔓延和流行，对我国水禽养殖业造成重大的经济损失。

鹅细小病毒宿主特异性强，仅能在鹅(鸭)胚或鹅(鸭)胚成纤维细胞上增殖[4]。由于鹅细小病毒病在我国广泛流行，鹅(鸭)胚内可能存在的母源抗体会阻碍病毒的复制和生长。此外，鹅(鸭)胚供应的持续性会受产蛋周期等因素的影响，使得鹅细小病毒的持续性培养受到限制，因此疫苗的生产也会受到影响。研究表明，鹅(鸭)胚成纤维细胞的生长可连续传代致40代而不受影响[5]。因此，鹅细小病毒的持续性培养可通过鹅(鸭)胚成纤维细胞大量冻存或连续传代获得。

本研究将鹅细小病毒YG株在鹅胚和鸭胚成纤维细胞上进行交替传代培养，通过观察细胞有无出现特征性细胞病变(CPE)，检测病毒在细胞中的最佳培养时间，病毒TCID50的测定，从而发现不同代次细胞适应毒株在鹅胚和鸭胚成纤维细胞的生长特性；动物致病性试验表明，第50代细胞毒毒力明显减弱，且病毒效价高，该细胞适应毒株的培育为鹅细小病毒细胞适应弱毒苗的研制奠定了基础。

1材料与方法

鹅细小病毒YG株由本实验室分离、鉴定并保存；鹅(鸭)胚成纤维细胞(GEF/DEF)按照常规方法制备[4-6]；抗鹅细小病毒VP3蛋白单克隆抗体为本实验室制备[6]；无母源抗体的1日龄雏鹅及11日龄鹅胚均购自哈尔滨新立养殖场；11日龄SPF鸭胚购自哈尔滨兽医研究所实验动物中心。

1.2试剂和主要仪器

胎牛血清购自Gibco公司；DMEM购自Hyclone公司；FITC标记的羊抗小鼠IgG抗体购自中杉金桥生物技术有限公司；EVOS F1荧光倒置显微镜为美国AMG公司产品。

1.3鹅细小病毒在细胞上的传代培养

原代GEF 制备好后传至次代，将鹅细小病毒YG株鸭胚尿囊液按1∶100的比例加入到细胞悬液中，培养至第7天时，置于-20 ℃，反复冻融3次，收集细胞培养液。将收集的细胞培养液按1∶150的比例加入到次代GEF细胞悬液中，培养至第4天时，按上述方法收集细胞培养液。在GEF上连续传代培养12代后，将收获的细胞适应毒在DEF上传代5次，之后回传至GEF，如此在GEF与DEF上交替传代培养直至细胞适应毒株第50代。

1.4间接免疫荧光试验(IFA)检测感染病毒的细胞数量

将鹅细小病毒按“1.3”所述方法感染GEF和DEF，感染5 d后，弃去细胞培养液，细胞用4%多聚甲醛室温固定30 min后，PBS洗3次。加入含有1% Triton X-100的PBS，置于4 ℃ 10 min后，用PBS洗3次后，加入含4% BSA的PBS置于37 ℃ 30 min。PBS洗1次后，加入1∶5 000倍稀释的抗鹅细小病毒VP3蛋白单克隆抗体，37 ℃ 孵育2 h。PBS洗3次后，加入1∶50倍稀释的FITC标记羊抗鼠IgG抗体，37 ℃ 孵育1 h后，PBS洗3次[6-7]。同时设立未感染GPV的GEF、DEF作为阴性对照，并在荧光显微镜下观察有无特异性绿色荧光。

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1.5不同代次细胞毒TCID50的测定

将不同代次的细胞适应毒用DMEM作10倍倍比稀释后，接种于单层GEF，每个稀释度做4个重复，培养至第5天时观察CPE，并按照Reed-Muench法[8]计算其TCID50。

1.6IFA检测不同时间内GEF感染病毒的情况

将鹅细小病毒细胞适应毒按“1.3”所述方法感染GEF，并且在感染后24、48、72、96、120和144 h，按“1.4”的方法，利用IFA检测不同时间细胞感染病毒的情况，并设立未感染鹅细小病毒的GEF作为阴性对照。

1.7鹅细小病毒细胞适应毒对易感雏鹅的致病性变化

45只1日龄雏鹅适应性饲养2 d后，随机分为3组，腿部肌肉分别注射鹅细小病毒YG株亲代毒株0.1 mL·只-1记为F0组，另一组注射第50代细胞适应毒株0.1 mL·只-1(约105.7TCID50)记为F50组，剩余1组注射PBS设为对照。隔离饲养3周，记录各组的体重变化、发病及死亡情况。无菌采集死亡雏鹅的肝、脾、肠道及其内容物，将病料剪碎后，使用玻璃匀浆器研磨制成组织匀浆。病毒基因组DNA采用SDS和蛋白酶K的方法提取[9]，并利用本实验室建立起来的GPV PCR检测方法[10]对死亡雏鹅进行确诊。

2结果

2.1鹅细小病毒在细胞上的适应性生长

将鹅细小病毒YG株在GEF上连续传代培养，在光学显微镜下观察细胞病变。

培养F1至F11代，感染细胞均未见明显的细胞病变；当细胞适应毒株传至第F12代时，感染细胞发生皱缩、变圆，其间隙增宽，细胞膜边缘不整齐，细胞质内呈现颗粒样变化及出现空泡，病变细胞聚集成团，但并未融合；病变严重的细胞甚至从培养瓶壁上脱落(图1)。将感染鹅细小病毒的细胞用4%多聚甲醛固定后，采用IFA进行检测，荧光显微镜下可见两种细胞细胞核处出现特异性绿色荧光，部分细胞核内存在有颗粒样荧光。Reed-Muench法计算获得的不同代次细胞毒的TCID50随着传代次数的增加，病毒滴度逐渐升高(图2)。结果表明，鹅细小病毒YG株能够在GEF、DEF上适应性生长。

2.2GEF培养病毒的最佳时间段

选取2个代次(F40和F50)的YG细胞毒接种于单层GEF，在感染后24、48、72、96、120和144 h，采用IFA法，检测不同时间段内病毒感染细胞的情况。

免疫荧光结果显示，F40和F50代次毒细胞培养24、48、72和96 h时，荧光数量(即阳性细胞数)随着培养时间的增加而逐渐增多；病毒培养超过96 h后，荧光数量随着培养时间的增加而逐渐减少。确定感染后96 h的荧光最多(图3)，建议在病毒的传代培养过程中，接毒后96 h，收获病毒。

2.3鹅细小病毒 F50对雏鹅的致病性

2.3.1临床表现、发病率、死亡率及体重变化F0组雏鹅在感染后第3天开始出现死亡，临床表现为病雏突然倒地，双腿麻痹或抽搐，两肢乱划，死亡前并无明显临诊症状，发现症状后极度衰弱，不久后死亡。F0组未死亡雏鹅随后均出现精神不振，虽多有饮水但食欲减退，排灰白及淡黄绿色稀粪，肛周不洁，鼻孔有分泌物流出，喙端色泽变暗，羽毛松乱等症状。F0组感染雏鹅均有发病，发病率为100%，死亡率为73.3%。F50组分别在感染后第6天和第9天各死亡一只雏鹅，死亡雏鹅在采食、饮水、精神状态及排便等方面均无异常，该组发病率为0，死亡率为13.3%。对照组雏鹅未出现临诊症状和死亡(图4)。

试验雏鹅感染后每周称量体重，随着饲养时间的增加，F0和F50组雏鹅陆续出现死亡，称量各组存活雏鹅的体重。结果显示F0组雏鹅与F50组及对照组相比，生长受到抑制，体重增加缓慢(图5)；F50组与对照组相比，体重无明显差异。

上述结果表明，GPV经过在DEF与GEF上交替传代培养，第50代细胞适应毒F50与其亲代毒F0相比，毒力明显减弱，主要表现为F50所感染雏鹅无明显临诊症状，并且发病率和死亡率大幅降低。此外，F0所感染雏鹅生长受到抑制，而F50所感染雏鹅体重变化与对照组并无差异，生长良好。

2.3.2剖检变化经剖检后发现，F0组中约有85%的病死雏鹅存在GPV感染的特征性病变。死亡雏鹅的肝淤血、肿大，且质脆；肾肿大出血，呈暗红色；病死雏鹅的小肠中下段特别是靠近卵黄柄和回盲部极度肿大，质地坚实，体积是正常肠段的2倍以上，空肠和回肠出现急性卡他性—纤维素性坏死性肠炎，将肿大肠段剪开后，可见整片肠黏膜坏死脱落，与凝固的纤维素性渗出物形成淡灰色栓塞，堵塞肠腔。F50组死亡雏鹅经过剖检后发现，肝和小肠并无上述病理变化，肾轻微肿大但未见出血(图6)。病理变化的结果进一步说明GPV细胞适应毒F50与其亲代毒F0相比，毒力明显减弱，F50所感染雏鹅，剖检后并未出现GPV感染的特征性病变。

2.3.3死亡雏鹅实验室诊断结果 利用本实验室建立的GPV PCR检测方法对病毒DNA模板进行检测，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，出现

GPV特有的长度约700 bp的特异性条带，与预期目标条带大小一致(图7)，结果表明F0和F50组雏鹅的死亡是由GPV感染所引起。

3讨论

本研究发现病毒在细胞培育连续培养过程中，病毒传至第12代后出现细胞病变；细胞病变多发生在接毒后的72～96 h。随着在细胞传代次数的增加，细胞病变愈发明显，且毒价也在持续升高；当病毒传至第50代时，毒价可达106.5TCID50·mL-1。利用IFA检测细胞培养不同时间后病毒的感染情况，结果显示，病毒的生长随着感染时间的延长呈现先增加随后又减少的变化趋势；在接毒后96 h，感染病毒的细胞数量最多。在接毒96 h后，随着培养时间的不断延长，细胞特异性荧光数量逐渐减少，原因是由于感染后期大量细胞死亡脱落所引起的。致病性试验结果表明，病毒经过体外的连续传代培养，第50代细胞适应毒与其亲本毒相比，毒力明显减弱，主要表现为其所感染的雏鹅发病率和死亡率降低，并且死亡雏鹅无鹅细小病毒病的特征性病变及临床表现。

本研究结果显示鹅细小病毒在GEF和DEF上交替传代培养与其毒力的减弱有着重要关系。随着病毒在细胞上的连续传代培养，宿主细胞与病毒的不断相互作用，使得病毒的毒力相关基因受到修饰而发生改变，使其毒力减弱甚至失去对宿主动物的致病能力，这一结论与以往的研究结果相一致[5，12-13]。本研究获得的毒力明显减弱的鹅细小病毒细胞适应毒株为今后弱毒苗的研制奠定了基础，国际上对于鹅细小病毒的致弱机制国内外未有报道，这为我们今后的研究提供了新的方向。

4结论

鹅细小病毒YG株在鹅胚成纤维细胞和鸭胚成纤维细胞上交替传代培养，至第50代时毒力减弱，感染雏鹅后死亡率和发病率降低，且死亡雏鹅无鹅细小病毒病的特征性病变及临床表现。

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(编辑白永平)

Pathogenicity Changes of Cell Attenuated Goose Parvovirus YG Strain

SHAOZHOU Wu-lin，LI Chen-xi，LIU Ming，ZHANG Qing-shan，ZHANG Yun*

(StateKeyLaboratoryofVeterinaryBiotechnology，HarbinVeterinaryResearchInstitute，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Harbin150001，China)

Key words:goose parvovirus；virus attenuation；cell adaptation；pathogenicity change

Abstract:This experiment was conducted to study pathogenicity changes in susceptible goslings of cell attenuated goose parvovirus YG strain.To obtain attenuated vaccine strain，goose parvovirus(GPV) YG strain was propagated alternately in goose embryo fibroblasts(GEF) and duck embryo fibroblasts(DEF).Cells infected with YG strain began to induce cytopathogenic effect after 12 passages.Results of indirect immunofluorescence assay(IFA) showed that the numbers of infected cells with green fluorescence increased with the time of infection，and the highest number of positive cells were obtained at 96 h post-infection.Virus titers increased with serial passages going and virus titer reached 106.5TCID50·mL-1after passage 50.Compared to parental virus，the mortality and morbidity of goslings decreased obviously after challenged with virus passage 50.There were no observed characterized pathogenic changes or clinical symptoms of Derzsy’s disease in goslings after challenged with passage 50 YG virus.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.01.018

收稿日期：2015-03-30

基金项目：现代农业水禽产业技术体系岗位科学家专项(CARS-43-10)；国家自然科学基金面上项目(31072132)

作者简介：邵周伍林(1990-)，男，云南昆明人，硕士生，主要从事水禽病毒病的研究 *通信作者：张云，副研究员，硕士生导师，E-mail：yunzhang01@126.com

中图分类号：S852.659.6

文献标志码：A

文章编号:0366-6964(2016)01-0135-06