马立克病病毒与禽网状内皮增生病病毒的混合感染及在传代过程中的重组

宿靖伟，滕　蔓，罗　俊，*，迟佳琦，余祖华，禹乐乐，胡　博，张改平*

(1.河南省农业科学院动物免疫学重点实验室，农业部动物免疫学重点实验室，河南省动物免疫学重点实验室，郑州 450002；2.河南农业大学牧医工程学院，郑州 450002；3.河南科技大学动物科技学院，动物疫病与公共安全重点实验室，洛阳 471003)



马立克病病毒与禽网状内皮增生病病毒的混合感染及在传代过程中的重组

宿靖伟1，2，滕蔓1，罗俊1，3*，迟佳琦1，余祖华3，禹乐乐1，胡博1，张改平1，2*

(1.河南省农业科学院动物免疫学重点实验室，农业部动物免疫学重点实验室，河南省动物免疫学重点实验室，郑州 450002；2.河南农业大学牧医工程学院，郑州 450002；3.河南科技大学动物科技学院，动物疫病与公共安全重点实验室，洛阳 471003)

摘要：旨在了解国内鸡群马立克病病毒(MDV)和禽网状内皮增生病病毒(REV)的混合感染及自然重组状况，探讨两种病原的基因重组对MDV病原学特性的潜在影响及危害。利用PCR扩增、序列测定及间接免疫荧光试验(IFA)，对来自河南商品蛋鸡群的17个MDV分离株进行研究。结果表明，其中两个毒株HNGS206和HNXZ103的病毒基因组中存在REV—LTR的重组插入。进一步的IFA结果显示，HNGS206和HNXZ103并非MDV与REV的自然重组流行毒株，这两个毒株基因组中LTR的插入发生于临床病例鸡混合感染后的病毒分离及传代培养过程中。结果提示，虽然目前国内鸡群中MDV和REV的混合感染较为普遍，但MDV与REV自然重组毒株的流行状况仍需要进一步的流行病学监测。

关键词：马立克病病毒；禽网状内皮增生病病毒；流行病学；混合感染；病毒传代；基因重组

此前研究发现，REV基因组RNA转录产生的DNA中间产物(即前病毒)可以整合到宿主细胞的DNA中。由于REV前病毒的整合靶标为双链DNA，除宿主细胞DNA外，它还可以整合到细胞内共存的其他禽疱疹病毒基因组中，如MDV[8-10]。1992年，这种现象首次报道于MDV和REV共感染细胞的传代培养过程中[8]，之后美国[11]、波兰[12]及我国学者[13]都先后报道了关于MDV和REV重组相关的研究。值得一提的是，REV的部分基因组片段如长末端重复序列(long terminal repeat，LTR)重组进入MDV基因组可改变其重组位点附近基因的表达[14-15]。无论是经过共培养或是细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome，BAC)技术构建的含REV-LTR插入的MDV毒株，在细胞中的增殖明显增强，并且对宿主的致病力也发生了一定改变[15-16]。进一步的研究发现，REV-LTR的插入可增强MDV的水平传播能力[17-18]。上述研究表明，MDV基因组中整合REV前病毒基因序列可能影响其病原生物学特性及致病性。因此，系统研究鸡群中自然发生的MDV重组毒株的流行病学，对MD的有效防控具有重要意义。

在实际生产中，尽管小鸡出孵当天即进行MDV疫苗免疫接种，MD病例在我国仍时有暴发或零星散发。2005年，MDV与REV重组毒株在我国的流行及病毒分离首次报道于广西省鸡群[13]，但这种重组病毒对国内养禽业的潜在影响目前尚不清楚。近年来，河南全省范围内多个地区小规模蛋鸡场暴发了MD[19-20]，作者从这些发病鸡群中成功分离到17个MDV流行毒株[21]，并且基于Meq、gB和gE基因系统发生树分析发现与美国、澳大利亚、日本以及印度的MDV分离株相比，河南分离株与国内其他分离株一起单独形成一个较大的进化分支，并且强毒株具有一定的区域流行特征[20-21]。为了解国内鸡群流行毒株中MDV和REV的自然重组状况，本研究对这些分离株中REV的共感染及重组情况进行了进一步追踪研究。

1材料与方法

1.1毒株

MDV河南分离株17个，包括HNGS101(p5)、HNGS201(p4)、HNGS206(p2、p3、p4、p6)、HNXZ101(p5)、HNXZ103(p3、p4、p9、p11)、HNXZ106(p5)、HNLC107(p4)、HNLC202(p4)、HNLC203(p4)、HNLC401(p5)、HNLC502(p4)、HNLC503(p4)、HNLH302(p5)、HNLH303(p7)、HNLH304(p5)、HNLH305(p4)和HNSC105(p11)，均由本实验室分离保存[21]。MDV超强毒株GX0101(病毒基因组中整合有REV-LTR序列)[13，17，22]和REV分离株HA9901[23]，均由山东农业大学动物医学院崔治中教授馈赠。

1.2试剂

Premix ExTaqTM、Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、pMD19-T载体连接试剂盒和JM109感受态细胞，均购自TaKaRa公司。TRIzol购自Invitrogen公司。DMEM培养基购自Gibco公司。胎牛血清购自Hyclone公司。 REV gE蛋白单抗(11B118)和MDV gB蛋白单抗(BA4)，均由山东农业大学动物医学院崔治中教授馈赠。荧光标记的羊抗鼠IgG购自Abbkine公司。

城乡学生运动素质指标比较（表3）调查显示，除握力外，城市和农村男生50m跑、立定跳远、耐力跑、肌力、坐位体前屈差异均有统计学意义（P＜0.01），除肌力外，城市和农村女生的50m跑、立定跳远、耐力跑、肌力、坐位体前屈差异均有统计学意义（P＜0.01）。

1.3病毒培养及DNA提取

取7～9日龄SPF鸡胚，制备鸡胚成纤维细胞(chicken embryo fibroblast，CEF)用于MDV GX0101超强毒株、HNGS101等河南分离株及REV分离株HA9901的病毒接种及扩大培养[21]，观察细胞病变并收集病毒感染细胞，各MDV毒株及阴性对照细胞DNA的提取按此前文献报道方法进行[21]，-30 ℃冻存备用。

1.4RNA提取

取1.3所述MDV、REV各毒株感染的CEF细胞及CEF阴性细胞，用TRIzol法常规提取总RNA，用NanoDrop ND1000分光光度计测定RNA浓度，并用甲醛变性胶电泳进行分析，检测提取的RNA完整性，-30 ℃保存备用。

1.5引物设计

根据GenBank中已报道的MDV参考毒株Md5病毒基因组序列，用Primer Premier 5.0软件设计MDVgE基因特异性引物1对(表1)。同时，根据已报道的REV代表性毒株基因序列，分别设计针对REV-LTR、pol及gag基因的特异性引物各1对(表1)。上述引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1MDV和REV基因扩增引物

Table 1 Primers specific for the viral genes of MDV or REV

1.6PCR及基因克隆测序

取“1.3”所提取的DNA作为模板，以GX0101感染细胞DNA和CEF阴性细胞DNA分别作为阳性及阴性对照，用 MDVgE基因及REV-LTR基因的特异性引物(表1)进行PCR扩增。20 μL的PCR体系包括：ExTaqDNA聚合酶10 μL，20 μmol·L-1的上下游引物各0.5 μL，200 ng·μL-1的DNA模板各1 μL，ddH2O 8 μL。MDVgE基因的PCR反应条件：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s、58 ℃复性30 s、72 ℃延伸2 min，共30个循环；最后72 ℃延伸10 min。 REV-LTR基因的PCR反应条件：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s、58 ℃复性30 s、72 ℃延伸30 s，共30个循环；最后72 ℃延伸10 min。对各PCR产物进行基因克隆[20-21]，最后送样至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

1.7RT-PCR

取“1.4”所述RNA样品各2 μg，以REV HA9901感染细胞RNA和CEF阴性细胞RNA样品分别作为阳性及阴性对照，用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒按照试剂盒操作说明书去除基因组DNA，然后用REVpol、gag基因下游引物(表1)进行反转录，各取cDNA 1 μL用于PCR扩增。20 μL的PCR体系包括：ExTaqDNA聚合酶10 μL，20 μmol·L-1的上下游引物各0.5 μL，cDNA模板各1 μL，ddH2O 8 μL。REVgag基因的PCR反应条件：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性45 s、55 ℃复性45 s、72 ℃延伸45 s，共30个循环；最后72 ℃延伸10 min。REVpol基因的PCR反应条件：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性45 s、60 ℃复性45 s、72 ℃延伸45 s，共30个循环；最后72 ℃延伸10 min。各取4 μL PCR产物，用2%琼脂糖凝胶进行电泳分析。

1.8间接免疫荧光试验

常规方法制备CEF，至细胞形成单层后即可接种病毒[21]。用含1%胎牛血清的DMEM重悬MDV河南分离株、GX0101及REV分离株HA9901的病毒液，MDV按每孔10 PFU·100 μL-1、REV按每孔103TCID50·100 μL-1的剂量各接种3孔，同时设3孔未接毒细胞作为阴性对照，于5% CO2培养箱中培养4～5 d，当出现明显病毒蚀斑或细胞病变时，用REV单抗11B118和MDV单抗BA4分别进行间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescent assay，IFA)[18]，检测两种病毒共感染情况。

2结果

2.1MDV分离株gE基因及REV-LTR的PCR

对GX0101和HNGS101等河南分离株最高代次病毒感染的CEF细胞DNA进行gE基因的PCR扩增，电泳分析结果显示，17个分离株样品及GX0101阳性对照中均扩增出与预期大小相符的特异性PCR产物，而CEF阴性对照样品未扩增出任何产物(图1A)，表明成功进行病毒分离株的复苏及传代培养。而对REV-LTR基因的PCR扩增结果显示，MDV河南分离株中，仅有HNGS206(p6)和HNXZ103(p11)的DNA中扩增出了与预期大小相符的PCR产物，与阳性对照GX0101的扩增结果一致(图1B)，表明这两个MDV分离株基因组中可能存在REV-LTR的重组。

2.2MDV分离株REV-LTR的PCR产物测序

将从HNGS206和HNXZ103分离株DNA样品中扩增的REV-LTR PCR产物割胶回收并克隆测序，分析结果显示，两个PCR产物的序列长度均为367 nt，与预期产物长度完全一致。用MegAlign软件进行比对分析显示，二者仅第48和第289位核苷酸不同。Blast分析结果显示，与GenBank中已发表的REV多个毒株的LTR序列相比，两个扩增片段的核苷酸序列相似性均达到99%。上述结果表明，MDV分离株HNGS206(p6)和HNXZ103(p11)病毒基因组中确实存在REV-LTR的重组。

2.3MDV分离株中REVgag和pol基因的RT-PCR

为探讨这两个MDV分离株病毒基因组中REV-LTR重组是自然携带的还是共感染培养引起的，对HNGS101等MDV河南分离株最高代次病毒感染的CEF细胞RNA分别进行REVgag和pol基因的RT-PCR扩增，结果显示仅有分离株HNGS206(p6)、HNXZ103(p11)和阳性对照HA9901中扩增出了与预期大小相符的RT-PCR产物(图1C和1D)，表明这两个MDV河南分离株中可能存在REV。

2.4MDV分离株中REV的IFA检测

为了进一步确证MDV河南分离株中是否混合感染了REV，分别用HNGS101等河南分离株的最高代次病毒接种CEF细胞并进行IFA检测。结果显示，MDV河南分离株感染的CEF细胞全部呈现MDV gB蛋白单抗BA4的特异性病毒蚀斑荧光染色，仅有两个分离株HNGS206(p6)和HNXZ103(p11)感染的CEF细胞呈现REV gE蛋白单抗11B118特异性荧光染色，未接毒CEF细胞对照均为阴性(图2)。上述结果表明，在17个MDV河南分离株中，HNGS206和HNXZ103中确实存在REV的共感染。

2.5MDV分离株中REV共感染及LTR重组的溯源分析

为了追溯HNGS206和HNXZ103中REV的共感染及LTR重组的来源，对这两个毒株不同代次病毒均进行了REV的gag和pol基因的RT-PCR扩增以及IFA检测。RT-PCR产物的电泳分析结果显示，分离株HNGS206的p2～p3代病毒RT-PCR均为阴性、但p4～p6代病毒均为阳性，而分离株HNXZ103的p3～p11代病毒RT-PCR均为阳性(图3A和3B)，与上述对HNGS206或HNXZ103各不同代次病毒进行的REV IFA结果一致。对用于MDV分离传代培养的各批次CEF阴性细胞进行的同步检测结果表明，gag和pol基因的RT-PCR及REV IFA结果均为阴性，因此排除了在病毒传代培养过程中人为污染REV的可能性。上述分析结果表明，MDV分离株HNGS206和HNXZ103中的REV来源于临床病例鸡的两种病毒的混合感染。进一步对这两个MDV分离株的不同代次病毒DNA进行REV-LTR PCR扩增的结果显示，HNGS206的p4～p6代和HNXZ103的p3～p11代LTR均为阳性(图3C)，表明在MDV分离后传代培养至第3～4代，MDV和REV即发生了基因重组。

3讨论

近年来，MDV流行毒株的毒力不断增强，目前国外已分离鉴定了多株超超强的MDV毒株(very virulent plus MDV，vv+MDV)，促使MDV毒力不断增强的最主要因素可能与MDV疫苗的广泛使用及免疫压力有关。MDV与REV的混合感染是导致免疫失败的重要因素之一[24]。已有研究证实，MDV和REV的体外共培养可导致两种病毒的基因重组[8-10]，国内学者崔治中等研究发现，MDV—REV的重组野毒株GX0101在病毒基因组重组插入LTR片段后，其致病性虽然有所降低，但其水平传播力却有所增强[13，17-18]。国外多项研究也表明，基于REV-LTR整合位点的不同，其引起MDV的致病性、复制力、水平传播能力等病原学特性也有差异[8-10，14-16]。因此，进一步深入研究MDV和REV的体外重组及流行病学情况，对于今后有效防控MD具有重要意义。

为了解国内鸡群中MDV—REV共感染及重组毒株的流行情况，本研究对此前分离自河南不同地区鸡群的17个MDV野毒流行株进行分析，结果发现这17个MDV分离株中有2个毒株HNGS206和HNXZ103的病毒基因组中存在REV-LTR的重组。对HNGS206和HNXZ103各不同代次培养病毒进一步的溯源研究发现，这种基因重组最初极有可能是因为在临床病例鸡体内就已经发生MDV和REV的混合感染。作者进一步研究的结果证实，随着后续病毒分离培养及传代3～4代，两种病毒进而发生了LTR的基因重组，这种体外重组与国外相关学者的研究基本一致[8，11-12]。稍显遗憾的是，在最初病毒分离时，本研究未能同步保存病例鸡的血样或脏器样本。若能对原始病料的病理组织切片进行MDV和REV混合共感染IFA或PCR检测，将更有助于两种病毒基因重组的溯源分析，这是后续相关研究需要进一步改善的。

鉴于国内外鸡群REV与MDV混合感染的普遍性，很多研究人员正致力于研发可针对两种病毒的二价疫苗或重组疫苗。B.Lupiani等成功将REV—LTR插入CVI988疫苗株的病毒基因组中，该重组疫苗已被证实在细胞培养中的生长率及免疫保护力均有一定程度的提高[25]。尽管如此，由于目前MDV和REV重组的生物学意义尚不明确，此类疫苗的临床使用，仍将存在着促进两种病毒体外重组及大面积流行的巨大隐患。根据本研究的结果，MDV—REV重组毒株可能只是来源于宿主体内的混合感染及病毒分离培养，而非自然界存在的自然重组毒株的广泛流行。此前研究发现，LTR内的启动子和增强子很可能会改变MDV基因组插入位点附近的基因表达[14]，REV也可能通过MDV来帮助自身的传播，这可能带来严重后果。与MDV不同，REV除水平传播外还可以垂直传播，REV序列的重组很可能拓宽MDV的传播途径，从而加速其流行并带来难以估计的损失[26]。总之，MDV与REV的混合感染及基因重组对于MDV的病原学特性及致病性的影响仍有待进一步的深入研究，因此继续加强MDV的流行病学监测对该病的有效防控至关重要。

4结论

从17个MDV分离株中，分析鉴定了两个基因重组毒株HNGS206和HNXZ103，这两株病毒基因组中均存在REV-LTR基因片段的插入。进一步的溯源研究结果发现，HNGS206和HNXZ103并非MDV与REV的自然重组毒株，REV-LTR的重组可能发生于两种病毒共感染宿主后的病毒分离培养及细胞传代过程中。国内鸡群是否存在MDV自然重组毒株的流行仍需要进一步的流行病学监测。

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(编辑白永平)

Co-infection of Field Marek’s Disease Virus with Reticuloendotheliosis Virus Prevalent in Vaccinated Chicken Flocks

SU Jing-wei1，2，TENG Man1，LUO Jun1，3*，CHI Jia-qi1，YU Zu-hua3，YU Le-le1，HU Bo1，ZHANG Gai-ping1，2*

(1.KeyLaboratoryofAnimalImmunologyoftheMinistryofAgriculture，HenanProvincialKeyLaboratoryofAnimalImmunology，HenanAcademyofAgriculturalSciences，Zhengzhou450002，China；2.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，HenanAgriculturalUniversity，Zhengzhou450002，China；3.KeyLaboratoryofAnimalDiseaseandPublicSafety，CollegeofAnimalScienceandTechnology，HenanUniversityofScienceandTechnology，Luoyang471003，China)

Key words:MDV；REV；epidemiology；co-infection；virus passage；gene recombination

Abstract:This study was performed to investigate the co-infection and natural recombination of Marek’s disease virus (MDV) and reticuloendotheliosis virus (REV) in chicken flocks in China，and evaluate the potential influences of viral recombination on MDV biology.Based on polymerase chain reaction (PCR)，DNA sequencing and indirect immunofluorescent assay (IFA)，we presently studied a total of 17 MDV field isolates obtained from the vaccinated chicken flocks in Henan province.The PCR results showed that，among the 17 Henan isolates，two isolates，HNGS206 and HNXZ103，are recombinant MDVs containing the REV-LTR inserts.Subsequent experiments showed that neither of the two isolates are natural recombinant viruses and the integrations of LTR into the viral genomes may result from the clinical co-infection and/or virus isolation procedure.Our data indicates that although a wide-spread co-infection of both MDV and REV exists in chicken flocks in China，the epidemiology of the naturally occurring recombinant MDVs needs to be further monitored.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.01.017

收稿日期：2015-03-23

基金项目：国家自然科学基金(31372445)；NSFC-广东省政府联合基金(U1131005)；河南省农业科学院优秀青年科技基金(2013YQ28)

作者简介：宿靖伟(1989-)，女，河南商丘人，硕士生，主要从事病毒分子生物学研究，Tel：0371-65756056，E-mail：sujingwei426@163.com *通信作者：罗俊，E-mail：luojun593@aliyun.com；张改平，E-mail：zhanggaiping2003@163.com

中图分类号：S858.315.3

文献标志码：A

文章编号:0366-6964(2016)01-0128-07