梅花鹿致敏与休眠鹿茸干细胞差异蛋白表达的2D-DIGE分析

2016-02-21 21:17王权威孙红梅李春义
畜牧兽医学报 2016年1期
关键词:鹿茸骨膜质谱

董 振,王权威,刘 振,孙红梅,李春义

(中国农业科学院特产研究所,特种动物分子生物学国家重点实验室,长春 130112)



梅花鹿致敏与休眠鹿茸干细胞差异蛋白表达的2D-DIGE分析

董振,王权威,刘振,孙红梅,李春义*

(中国农业科学院特产研究所,特种动物分子生物学国家重点实验室,长春 130112)

摘要:旨在对梅花鹿(Cervusnippon)致敏鹿茸干细胞与休眠鹿茸干细胞表达蛋白进行差异筛选、鉴定及生物信息分析,为深入探讨鹿茸独特的再生分子调节机制奠定基础。本研究采用双向荧光差异凝胶电泳(Two-dimensional fluorescence difference in gel electrophoresis,2D-DIGE)分离蛋白样品;利用DeCyder 7.2 分析软件对2D-DIGE图像进行统计学分析寻找差异表达蛋白;利用MALDI-TOF-MS (Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight tandem mass spectrometry)鉴定差异蛋白,通过Mascot 软件搜索NCBInr 数据库寻找匹配的蛋白;采用PANTHER (Protein Analysis Through Evolutionary Relationships) 软件对差异蛋白进行聚类分析,REACTOME数据库分析差异蛋白所参与的信号通路。结果得到了致敏鹿茸干细胞与休眠鹿茸干细胞2D-DIGE图谱,致敏鹿茸干细胞与休眠鹿茸干细胞蛋白丰度相比较,比值≥1.1倍以及比值≤-1.1倍(P<0.05)的差异蛋白点有159个,其中110个上调表达,49个下调表达,EDA(Extended data analysis)分析得到了多个Marker蛋白,质谱鉴定了84 个差异蛋白质点,48个为阳性结果,共来自27 种蛋白质。并对已鉴定蛋白进行了GO分析以及信号通路富集分析。致敏鹿茸干细胞与休眠鹿茸干细胞蛋白差异明显,质谱鉴定获得了来自多种可能与鹿茸再生相关的差异蛋白。由此可知,鹿茸再生是鹿茸干细胞从休眠到致敏的转化过程,需要多种蛋白分子以及信号通路的综合调控。

关键词:鹿茸干细胞;再生;蛋白质组学;2D-DIGE

近年来,再生生物学尤其是割处再生 (Epimorphic regeneration) 是生命科学研究的重点领域,鹿茸是迄今为止所发现的唯一一个可以割处完全再生的哺乳动物附属器官。以鹿茸为模型深入研究其独特再生分子调节机制对于揭开哺乳动物器官再生之谜具有重要意义[1]。鹿茸是以年为周期而再生的[2-3],春天鹿角从角柄脱落随即引发新一轮鹿茸再生;夏天,由茸皮覆盖的新生鹿茸迅速生长;进入秋天,成熟的鹿茸便会快速骨化并伴随茸皮脱落;到了冬天,骨化的鹿角会与角柄紧密相连从而等待新一轮鹿茸再生过程。在再生周期中,鹿茸可在短短几个月内完成生长发育[4],这一过程需要强大的血管营养供给系统才能辅助完成[5-6]。鹿茸具有远超癌细胞分裂速度的生长速度,但并不发生癌变[7-8]。鹿茸再生组织学研究表明,其周期性再生是来源于角柄骨膜中的细胞,这些细胞具有胚胎干细胞的特性,因此被称为鹿茸干细胞[2]。角柄高度具有种的特异性,如梅花鹿在5 cm左右[9]。C.Li等[10]发现,角柄骨膜根据与皮肤接触的紧密程度有一个比较明显的分界,即远心端大约1/3部分骨膜与所包裹的皮肤是紧密接触的;而近心端大约2/3部分骨膜与包裹皮肤连接疏松。C.Li等[11]进一步利用插膜试验表明,仅远心端角柄骨膜组织在与包裹皮肤相隔后仍具有再生鹿茸能力,而近心端插膜后则失去此能力。由此C.Li等将近心端骨膜与皮肤非紧密接触部分培养得到的细胞称为休眠鹿茸干细胞,相应的远心端骨膜与皮肤紧密接触部分培养所得到的细胞称为致敏鹿茸干细胞[2]。

在鹿茸蛋白质组学方面,H.J.Park等[12]通过双向电泳对赤鹿茸尖与血浆组织进行差异蛋白质组学研究,发现两者相近度高达43%,结果显示,鹿茸组织中含有一个发达的血管系统供给鹿茸快速生长的营养需求[13],并且鹿茸中含有多种代谢酶及基因表达调控蛋白等。但这仅是针对鹿茸的蛋白质组学研究,而C.Li等[14]利用双向电泳分别对鹿生茸区骨膜、角柄骨膜以及面部骨膜3种骨膜细胞蛋白质组进行比较,结果表明,生茸区骨膜细胞与角柄骨膜细胞中都鉴定到了大量差异蛋白,同时发现PI3K/Akt,ERK/MAPK,p38 MAPK等细胞信号通路在致敏鹿茸干细胞增殖时起关键作用,并在鹿茸干细胞中找到了胚胎干细胞的特异性标记物SOX2,NANOG和MYC等,从而推测鹿茸干细胞可能是一种介于成体干细胞与胚胎干细胞间的兼性干细胞。

目前对于与鹿茸再生关系密切的致敏鹿茸干细胞与休眠鹿茸干细胞的蛋白质组差异研究无人涉及。本试验采用双向荧光差异凝胶电泳(Two-dimensional fluorescene difference in gel electrophoresis,2D-DIGE)与MALDI-TOF-MS(Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry)对致敏鹿茸干细胞与休眠鹿茸干细胞进行差异蛋白质组研究,以期获得一些与鹿茸再生相关的差异表达蛋白,为最终发现刺激鹿茸再生的分子奠定基础。

1材料与方法

1.1供试材料

试验于2014年4月在中国农业科学院特产研究所实验鹿场进行,对1头屠宰后的梅花鹿(Cervusnippon)采集了角柄骨膜。利用冰盒将骨膜带回实验室进行细胞培养,鹿茸干细胞取材与培养方法见参考文献[14],将培养后收获的细胞于液氮中保存备用。

1.2蛋白质样品的准备

细胞培养瓶中将培养好的致敏鹿茸干细胞与休眠鹿茸干细胞弃去培养液,用山梨醇(Sigma-Aldrich公司)细胞清洗液清洗2次后收集细胞。再用山梨醇细胞清洗液悬浮洗涤细胞3次,每次悬浮后1 000 r·min-1离心5 min,并再次加入山梨醇细胞清洗液,最后1次加入500 μL自制裂解液(7 mol·L-1尿素,2 mol·L-1硫脲,4% CHAPS和1% 蛋白酶抑制剂)。之后将得到的两种细胞混合液中分别加入等量直径为0.5 mm的不锈钢珠并利用Bullet Blender 细胞组织破碎仪对细胞进行破碎,之后,将其放在冰盒中震荡4 h左右,随后12 000 r·min-1离心5 min,上清便为提取得到的蛋白。用Bradford法对蛋白样品进行浓度测定,并将含有蛋白的上清液100 μL·管-1分装后于-80 ℃冻存备用。

1.32D-DIGE

2D-DIGE具体操作参照丁新伦等的方法[15],与其操作不同的地方:利用Bio-Rad公司的2D Cleanup试剂盒按照说明书将蛋白样品进行纯化处理。采用GE 公司的CyDyeTMDIGE Fluor,minimal labeling kit对致敏鹿茸干细胞与休眠鹿茸干细胞蛋白样品进行荧光标记,Cy3 和Cy5 分别用于标记致敏鹿茸干细胞与休眠鹿茸干细胞蛋白,Cy2 标记两种细胞等量混合后的蛋白作为内标。第一向等电聚焦程序:S1 stp 250 V 1 h;S2 stp 500 V 1.5 h;S3 grd 1 000 V 1 h;S4 grd 4 000 V 7 000 Vh;S5 grd 8 000 V 6 750 Vh;S6 stp 8 000 V 35 000 Vh,整个聚焦过程总电压为56 kVh。第二向SDS-PAGE:将平衡好的胶条与12.5% SDS-PAGE 凝胶紧密结合并用封胶液进行封胶,将胶板置于GE ETTAN DALTsix 电泳系统,第二向电泳的程序:S1 2 W·gel-130 min;S2 17 W·gel-1,直至溴酚蓝跑到底,约4.5 h。

1.4扫描与图像分析

利用Typhoon FLA 9500(GE公司)获得2D-DIGE 的蛋白表达图像,分析软件为DeCyder 2D 7.2(GE)。整个分析使用DeCyder DIA(Difference in-gel analysis)、DeCyder BVA (Biological variation analysis)和DeCyder EDA(Extended data analysis)软件模块完成。每一匹配点的统计分析均采用Student’st检验比较致敏鹿茸干细胞与休眠鹿茸干细胞蛋白丰度的均值和标准差。并通过EDA模块进行Marker Selection分析,即使用偏最小二乘搜索(Partial Least Squares Search)与最邻近分类法(K-Nearest Neighbors)来鉴定两组样品中重要的差异蛋白。并取每组蛋白样品500 μg,混合后按与2D-DIGE试验相同的电泳参数进行双向电泳,之后进行SYPRO RUBY染色,并切取在2D-DIGE胶中丰度具有显著性改变(比值≥1.1倍以及≤-1.1倍,P<0.05)以及EDA模块分析得到的重要蛋白质点用于质谱分析。

1.5差异蛋白质点的酶解和MALDI-TOF-MS质谱鉴定

委托北京蛋白质组研究中心进行质谱检测。参照曹晓艳等的方法[16],质谱检测仪器为ABI 4800 Proteomics Analyzer MALDI-TOF/TOF。MALDI-TOF 质谱分析获得肽指纹图谱(Peptide mass fingerprint)数据以及MS-MS 数据,用MASCOT 软件搜索 NCBInr 数据库。检索条件:胰酶解,允许最大的未被酶切位点数为1,物种来源分别为人、野牛与牛,没有固定修饰,可变修饰 Oxidation (M),maximum peptide rank设为10,片段离子质量容差为0.3D。MASCOT检索蛋白质得分(P<0.05):野牛>57分;牛>61分;人>61分。

1.6差异蛋白的生物信息分析

采用PANTHER[17](http://www.pantherdb.org/,SRI International,Menlo Park,California,USA)对差异蛋白进行聚类分析,其主要根据蛋白分子功能、生物过程以及蛋白类别进行分类。由DAVID[18-19](http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.hsp)数据库对已鉴定蛋白所参与的信号通路进行富集分析。

2结果

2.1致敏鹿茸干细胞与休眠鹿茸干细胞蛋白表达差异分析

对Typhoon扫描的致敏鹿茸干细胞与休眠鹿茸干细胞蛋白标记的2D-DIGE图谱进行多通道叠加(图1)。DeCyder 7.2 软件分析每张胶平均得到约2 858 个蛋白质点(胶1:2 832个;胶2:2 805个;胶3:2 937个),各组间凝胶上蛋白点分布模式较为一致。共选出有统计学意义(比值≥1.1以及≤-1.1倍,P<0.05)的差异蛋白质点159 个(图 2),其中,致敏鹿茸干细胞/休眠鹿茸干细胞蛋白表达丰度升高的点有110 个,表达丰度下降的点有49 个。图3显示了部分蛋白质点上调和下调蛋白的曲线图和三维图。通过EDA模块Marker Selection分析得到所研究的两种细胞中重要的Marker蛋白,这些是后续质谱分析与功能验证的重点蛋白。

2.2差异表达蛋白MALDI-TOF-MS 鉴定

综合DeCyder软件BVA与EDA分析结果,从后续制备SYPRO RUBY蛋白胶中挖取84 个差异蛋白质点进行质谱分析,通过数据库检索成功鉴定出48 个蛋白质点,分属27 种蛋白,有多个点经鉴定为同种蛋白,其中,12 个蛋白质点表达上调,15 个蛋白质点表达下调。表1概括了质谱鉴定差异蛋白点的相关信息。

2.3差异蛋白的生物信息学分析

从生物学过程、分子功能及蛋白分类3 方面进行PANTHER 功能分析(图4)。图中显示,已鉴定的差异蛋白涉及多个生物学过程,包含生物起源、细胞代谢、定位、生殖、生物调节、刺激反应、发育过程、生物附着和免疫系统调节等;在分子功能上分属7 类,包括核苷酸结合转录因子活性、连接酶活性、受体活性、酶调节活性、结构分子活性、催化活性和载体活性;在蛋白分类上,差异蛋白来自多种类别,主要有转移/载体蛋白、细胞骨架蛋白、结构蛋白、受体蛋白、转运蛋白、核酸结合蛋白、转录因子以及水解酶类等。DAVID中REACTOME 通路分析结果如图5所示。

表1通过2D-DIGE得到的经质谱鉴定的差异表达蛋白

Table 1Differentially expressed proteins identified by mass spectrometry(MS) after 2D-DIGE analysis

3讨论

梅花鹿致敏鹿茸干细胞与休眠鹿茸干细胞差异蛋白质组学研究尚未见报道。本试验采用改进于传统双向电泳的荧光差异凝胶电泳技术对鹿茸干细胞进行研究。2D-DIGE技术因其灵敏度高,重复性好以及统计学可信度高等特点已成为与iTraq(Isobaric tag for relative and absolute quantitation)和SILAC(Stable isotope labeling with amino acids in cell culture) 同被使用的定量蛋白质组学技术。

3.1质谱鉴定中部分多点重复蛋白与鹿茸再生的关系

POTE可编码包含3个结构域的肿瘤睾丸抗原,并因主要在前列腺、卵巢、睾丸及胎盘中表达而得名。T.K.Bera研究发现[20],POTE蛋白在人胚胎干细胞系中表达,尤其是POTE-2会显著表达[21]。而本试验中POTE (spot1430、spot641和spot398) 在休眠鹿茸干细胞中高表达,可能预示着休眠鹿茸干细胞与胚胎干细胞相似,这与C.Li等[2]研究结果一致。而研究报道[20-21]该蛋白是灵长类动物特异表达蛋白,本试验在梅花鹿中找到了该蛋白,这表明其并不是灵长类特异表达的蛋白。

质谱数据发现,致敏鹿茸干细胞中有多个SAE1 (SUMO-activating enzyme subunit 1)(spot2433和spot1891等)蛋白高度表达,研究发现,Myc驱使的肿瘤生成依赖于SAE蛋白与SUMOylation修饰[22-23],从而维持肿瘤发生的特征[24]。C.Li等[14]证明,在角柄骨膜细胞中存在Myc,其具有调控细胞周期、细胞增殖、肿瘤生成、细胞分化以及细胞凋亡等多重作用[22,25],但Myc的具体生物学功能是由相应细胞微环境中参与的细胞因子所涉及的调控机制决定的[25]。由此可知,SAE1可能作为Myc的一类调控因子从而使Myc具有促使细胞快速增殖的作用,具体过程表现为当Myc因突变等而超极化后便会使细胞进行不可控的增殖甚至是肿瘤生成[24]。而SAE1不存在时,Myc驱使的细胞便会死亡。在Myc含量较高,SAE1较少时,Myc表达的细胞有更长的无转移存活率;但是SAE1较多时,Myc表达的细胞会癌变。结合试验结果,休眠鹿茸干细胞中SAE1相对含量较低,则表现为该细胞相对更稳定;而致敏鹿茸干细胞中SAE1较多,则Myc被激活,使得该细胞具有高度分化的特性与快速分裂增殖能力。生命体是一个平衡体,当抑癌作用高于致癌作用时,细胞便不会癌变,反之生命体便会失调致癌[24];而鹿茸干细胞可能同样如此,即存在抑癌调控体系,又存在致癌快速增殖体系如SAE-Myc,也许正是这些过程间的相互作用与相互制约从而使鹿茸组织既能快速生长又不癌化,具体机制有待进一步研究。

3.2生物信息学分析已鉴定的差异蛋白与鹿茸再生的关系

DAVID 信号通路富集分析表明差异蛋白主要参与止血通路与糖尿病通路。在鹿茸锯茸过程中,其截断面会因过大压力而喷出血柱,如果不能快速止血,鹿将会因失血过多衰竭而死,但实际情况表明止血过程很快,所以鉴定到的蛋白可能在角柄骨膜中高度表达从而促使快速止血。而V.Stéger 研究发现,鹿茸骨组织中的糖含量要高于正常骨组织的5倍以上[26],在正常组织中应表现为糖尿病症状,但对于鹿茸而言其需要大量的能量消耗来满足自身的快速生长,所以应该有一套完善的机制对高血糖进行消耗与利用从而促进鹿茸再生。

糖尿病通路所富集的蛋白中,ALDOB(Aldolase B)参与糖代谢,并涉及糖酵解与糖异生过程[27]。ALDOB蛋白还是一种胞内胰岛素结合蛋白[28],其与胰岛素结合的复合体涉及细胞生长调控,细胞分化以及蛋白质代谢等功能。所以在致敏鹿茸干细胞中ALDOB(spot295) 高表达可协助胰岛素利用细胞内的糖类为细胞大量增殖与分化供能。另外,ALDOB也参与Wnt通路[29]的正调控。在动物发育最早期,Wnt通路会对某些组织的损伤进行修复并修正促进再生的相关位置信息[30]。Wnt通路也涉及鹿茸再生过程,主要针对骨再生过程中的成骨细胞[31]。所以ALDOB可能既通过直接或间接作用参与致敏鹿茸干细胞内的糖代谢作用,也可调控其Wnt通路,从而促进鹿茸再生。

GRP78 (Glucose-regulated peptide 78) 是内质网中高度表达的分子伴侣,其能够促使蛋白正确折叠并降解错误折叠蛋白从而提高细胞存活率[32-33]。UPR (Unfolded protein response) 是一个当内质网腔内聚集的未折叠蛋白超过内质网折叠能力后(即内质网应激)所激活的高度保守的信号通路反应。GRP78是UPR信号出现后抑制内质网应激反应的主要调控者。GRP78主要由insulin/IGF-1通路调控来影响细胞增殖与存活,是其下游调控靶点[34]。最近研究表明,PI3K/AKT通路与GRP78蛋白互作以利于GRP78调控肿瘤生长以及阻止细胞凋亡,在肿瘤环境下,GRP78既可作为PI3K/AKT通路的下游靶点,又可作为其上游调控者。所以致敏鹿茸干细胞中GRP78(spot524) 含量较高,可能是鹿茸再生过程中内质网蛋白合成活动比较激烈,细胞分泌比较旺盛且细胞增殖速率较快从而需要大量GPR78进行调控导致的。

ITPR1 (Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor type 1) 是一个在受三磷酸肌醇(IP3)刺激后从内质网中调控钙离子释放的细胞内通道,通过激活钙调蛋白,细胞内钙离子便会从内质网中释放从而引发细胞凋亡,最终导致下游细胞凋亡通路的活化[35]。由此可知,ITPR1 (spot323) 在休眠鹿茸干细胞中高表达可能起监控作用,即确保细胞正确合成调节型分泌途径的蛋白并诱导癌变细胞凋亡。ITPR1参与内质网应激的调控可能与GRP78的作用有一定的联系,其在鹿茸干细胞中的具体作用机制有待进一步研究。

3.32D-DIGE图谱EDA判定的Marker与鹿茸再生的关系

DeCyder软件EDA模块可对2D-DIGE图谱进行统计分析从而做Marker判定,其结果相对可信。本试验鉴定到的阳性蛋白中有4个重要蛋白排行在EDA所判定的Marker前30位,按照Marker判定排序具体如下。

3.3.1三角形四肽重复蛋白36(Tetratricopeptide repeat protein 36,HBP21)本试验鉴定得到的HBP21(spot1243)是一个新发现的包含肽重复序列结构域(Tetratricopeptide repeat TPR)的蛋白,并能够与Hsp70羧基端互作。HBP21几乎在所有的恶性组织中表达,并在有肿瘤转移的组织中高表达。HBP21可通过抑制Hsp70参与对肿瘤细胞恶化与转移的抑制。与HBP21类似,HspBP1在细胞中大量广泛表达,并与Hsp70亲合力高且能抑制Hsp70的活性[36]。HeLa细胞中抗癌药物(长春新碱、紫杉醇以及依托泊苷)在不影响Hsp70表达的同时诱导HspBP1在肿瘤细胞上调2.0~2.5倍,之后HspBP1特异性结合并拮抗Hsp70,因此HspBP1使肿瘤细胞更容易在组织蛋白酶调控下凋亡。

致敏鹿茸干细胞中HBP21高表达,推测其可由角柄中活性分子的激活,而拮抗Hsp70活性从而抑制细胞癌化,并促使癌化细胞凋亡。

3.3.2组蛋白 H4 (Histone H4)组蛋白折叠微区有多种翻译后修饰,如乙酰化[37]与磷酸化[38]等。不同修饰态组蛋白能为不同染色体调控因子提供结合位点[39]。蝾螈晶状体是通过色素上皮细胞(Pigmented epithelial cells,PECs)转分化再生的,而去分化的PECs有类胚胎干细胞特性[40]。其中乙酰化Histone H4的增加是蝾螈PECs去分化过程中染色质调控的重要特征。

在胚胎发育中细胞内端粒会在快速增殖过程内持续缩短直到极短而激活DNA损伤通路,并最终限制细胞增殖能力。而端粒长度在斑马鱼鳍重复截断再生过程[41-42]中维持不变甚至延长,这可解释相关细胞所具有的高增殖分化能力。所以端粒长度维持及组织再生能力间存在直接关系。Histone H4等组蛋白表达量降低可引发由DNA损伤[43]导致的端粒功能异常。而乙酰化Histone H4的显著减少也会限制端粒功能。说明组蛋白尤其是Histone H4表达量与修饰状态可调控端粒功能。

本试验中,与致敏鹿茸干细胞相比休眠鹿茸干细胞中Histone H4(spot1360)的含量更高,说明该细胞可能与胚胎干细胞相近并可能存在较大再生潜力。而致敏鹿茸干细胞中Histone H4下调,细胞大量增殖分化导致端粒缩短。

3.3.3ATP合成酶beta亚基 (ATP synthase subunit beta,ATP5B)ATP合成酶在线粒体中涉及氧化能量代谢并对细胞功能的发挥起重要作用[44]。ATP5B是催化真核细胞ATP合成过程的限速步骤[45]。

由本试验结果可知,ATP5B(spot1331)在致敏鹿茸干细胞中高表达,即致敏鹿茸干细胞需进行更多的氧化能量代谢以支撑其快速增殖与分化等;但休眠鹿茸干细胞相对稳定,不需过多能量消耗。

3.3.4波形蛋白(Vimentin)本试验中得到的波形蛋白 (spot1133) 是主要存在于间充质细胞中的第3类中间纤维[46],是细胞骨架以及核被膜的主要成分。在成体组织中波形蛋白[47]是唯一能够在不同细胞类型中表达的中间纤维。在组织培养中,波形蛋白缺乏的成纤维细胞有异常的actin细胞骨架结构。另外,波形蛋白缺乏的成纤维细胞机械稳定性、运动性以及定向迁移能力会减弱[48]。在(去)分化、胚胎发育及肿瘤形成过程中,波形蛋白均起到重要作用。其在上皮间质转化(EMT,epithelial-mesenchymal transition)过程中被快速诱导表达。EMT在胚胎发育和伤口愈合等生理过程以及癌症侵袭、转移等病理过程中发挥重要作用,而波形蛋白在EMT中起关键作用[49-50]。

与体外培养的牙髓总细胞相比,在CD105阳性牙髓干细胞中波形蛋白的mRNA与蛋白均高表达。因此尽管波形蛋白不是牙髓特异性表达的,但它可作为牙髓再生的质量评价标准。体外培养的CD105阳性牙髓干细胞中敲除波形蛋白基因后细胞迁移活动会明显降低,表明波形蛋白在再生牙髓组织中表达可促使牙髓干细胞的迁移从而促进再生[51]。

由上可知,在鹿茸再生过程中,致敏鹿茸干细胞中波形蛋白高表达表明其具有更好的迁移性从而能较快的进行增殖与分化;而休眠鹿茸干细胞的运动性较差,稳定性较高。且波形蛋白可能对两种细胞actin的差异表达有一定影响。

3.4本研究蛋白鉴定结果的不足

本试验中,部分差异点由于凝胶点较淡,蛋白表达量过少或实际蛋白质与理论推断的蛋白质分子量和等电点不符等因素导致未被质谱鉴定出来。与此同时,由于目前没有梅花鹿的全基因组,导致缺乏特异数据库,从而只能选择物种相近数据库,这便使得数据库针对性较差,不能获得更准确的结果并出现假阴性,最终质谱阳性鉴定率下降。而所得数据中,actin、POTEE以及keratin等蛋白出现了多点重复鉴定,在蛋白图谱中这些蛋白点分离清晰、相距不远、具有不同的等电点,可能是其发生了磷酸化、甲基化或乙酰化等修饰。

综上表明,鹿茸再生是一个鹿茸干细胞从休眠到致敏的转化过程,这个过程需要多种蛋白分子参与以及信号通路网络的综合调控。

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(编辑郭云雁)

Analysis of Differentially Expressed Proteins in the Potentiated and Dormant Antler Stem Cells through 2D-DIGE

DONG Zhen,WANG Quan-wei,LIU Zhen,SUN Hong-mei,LI Chun-yi*

(StateKeyLaboratoryforMolecularBiologyofSpecialAnimals,InstituteofSpecialAnimalandPlantSciences,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Changchun130112,China)

Key words:antler stem cell;regeneration;proteomics;2D-DIGE

Abstract:The objective of this study was to screen,identify and analyze the differentially expressed proteins in the potentiated and dormant antler stem cells in sika deer (Cervusnippon),and then to shed lights on the molecular mechanisms underlying antler regeneration.The two-dimensional fluorescence of gel electrophoresis (2D-DIGE) was used to separate the protein spots;Differentially expressed protein spots were selected by DeCyder 2D (version 7.2);Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight tandem mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) was carried out to obtain peptide mass fingerprinting,Mascot software was used to search the matched proteins in the NCBInr database;PANTHER (Protein Analysis Through Evolutionary Relationships) and REACTOME analysis were performed to further explore the involved signal pathways about these identified proteins.The proteomic profile of the potentiated antler stem cells compared with the dormant antler stem cells was explored by 2D-DIGE.One hundred fifty-nine protein spots with more than 1.1-fold changes and less than -1.1-fold changes andPvalues less than 0.05 differentially expressed by the potentiated over the dormant antler stem cells,including 110 up-regulated and 49 down-regulated protein spots.Multiple markers were obtained by extended data analysis(EDA) module.MALDI-TOF-MS identified 84 differentially expressed protein spots and 48 of them which came from 27 kinds of proteins were positive.There is a significant difference at proteomic level between the potentiated and the dormant antler stem cells,and some identified proteins which are involved in multiple functional categories might be related to antler regeneration.Therefore,antler regeneration is a process from the dormant to the potentiated states in antler stem cells,which is regulated by multiple proteins and a complicated signal network.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.01.013

收稿日期:2015-02-04

基金项目:国家高技术研究发展计划(863)项目(2011AA100603);国家自然科学基金项目(31170950);吉林省重点科技攻关项目(20150204071NY);吉林省自然科学基金项目(20140101139JC)

作者简介:董振(1989-),男,吉林白城人,硕士生,主要从事鹿茸蛋白质组学研究,E-mail:xi.andz@163.com *通信作者:李春义,博士,研究员,主要从事鹿茸生物学研究,E-mail:lichunyi1959@163.com

中图分类号:S825;S813.3

文献标志码:A

文章编号:0366-6964(2016)01-0092-13

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