畜牧业领域中转基因动物技术的应用

达 赖，王凤武，李向宇

（内蒙古农牧业科学院，内蒙古 呼和浩特 010031）

畜牧业领域中转基因动物技术的应用

达 赖，王凤武，李向宇

（内蒙古农牧业科学院，内蒙古 呼和浩特 010031）

转基因技术以及转基因动物的出现是生物以及生命科学领域里程碑式的事件。转基因动物技术是研究基因功能、生物治疗医学以及探索生命本质关键事件的有效技术手段。虽然转基因技术的研究和应用在畜牧业领域起步较晚，但却拥有广阔的发展前景。综述了转基因动物关键技术及其在转基因家畜生产过程中所面临的主要问题，以期为后续研究提供参考。

转基因技术；转基因家畜；畜牧生产

1 在模式动物小鼠中干细胞及转基因技术的研究应用

1980年，Gordon等［1］发现外源DNA注射到由单一细胞胚胎而生成的转基因鼠中能够与小鼠基因组融合并表达，并且转基因鼠所获得的新的遗传性状是可以遗传的。自此，原核注射技术得到广泛应用，同时，该技术也成为哺乳动物基因功能研究的主要手段之一。转基因家畜的生产也采用了原核注射技术。相对于小鼠，利用原核注射技术及胚胎移植技术生产转基因家畜的成功比率大为降低。对于所有物种来说，应用原核注射普遍存在2个方面的问题，即插入位点的不可预测性和能够表达的转基因拷贝数。另外，该技术对所需遗传材料有着严格的限制。

随着鼠胚胎干细胞转基因技术的发展，原核注射技术所面临的障碍已经被部分规避［2-4］。胚胎干细胞系分离自早期胚胎中未分化的细胞，培养过程中具有分化为胚胎各个组织的潜能。因此，胚胎干细胞经体外修饰后，可返回到早期胚胎内正常发育，该过程可以产生嵌合体动物。嵌合体动物的所有组织，包括生殖细胞在内，通常由宿主胚胎和外源干细胞2种基因型构成。通过利用同源重组原理，在胚胎干细胞内以单拷贝外源基因为靶向定点原位修饰现有基因，可实现更为精准的遗传修饰。目前，限制该技术广泛应用的主要问题在于仅能在小鼠中获得类似全能的胚胎干细胞［5］。

2 在家畜中干细胞及转基因技术的应用及所面临的挑战

缺乏可利用的胚胎干细胞以及转基因动物的维护费用较高是导致利用原核注射技术生产转基因家畜效率较低的重要原因。虽然文献描述的转基因动物拥有广阔的前景，但是成功的例子却很少。利用转基因家畜生产价格昂贵的药用蛋白或许可以承受转基因动物生产的低效率和转基因动物维护的高成本。以细胞为基础的家畜克隆以及以细胞为基础的转基因技术的发展有可能改变这一现状。但是，据此认为转基因家畜会显著改变现有逻辑和生物界限的可能性并不大。

通过核移植或胚胎干细胞形成嵌合体的方式，在细胞层面上进行转基因的方法具有无可比拟的优势［6-8］。该种转基因方法不必直接对胚胎进行操作，而是对可不断进行繁殖的细胞进行遗传修饰。这就解决了遗传材料的限制性，同时使得操作更具有便利性和可行性，也可使转基因操作以一定的规模进行。因此，规模化操作后可以方便地检测外源基因是否表达，经筛选后可获得大量的转基因细胞。这些转基因细胞可以无限量地克隆繁殖，而每个克隆繁殖的转基因细胞都具有产生转基因动物的潜能。更方便的是，转基因细胞中的DNA在进行转基因动物生产前可进行编辑和修饰，从而使得生产的转基因动物更接近于试验和生产目标。而后，利用这些转基因细胞进行核移植，从而生产克隆动物，所产生的动物100%将是转基因动物［9］。该种基于细胞的转基因方法在家畜上已经取得成功，世界首例转基因绵羊“Polly”的生产就是基于该种方法。原则上讲，DNA通过同源重组整合进入基因组的比率非常低，因此，很难进行筛选鉴别。但是，通过遗传修饰的转基因克隆细胞能够提供可借鉴的手段和途径。尽管这并未在进行核移植的细胞中得到证明，但是，使用与鼠胚胎干细胞相同的常规技术已经在人体细胞中成功实现了基因的靶向修饰。然而，转基因克隆技术的一个主要应用方面有可能是通过基因的靶向修饰从而使体细胞携带有细微改变的基因进而生产转基因动物。唯一障碍在于符合基因打靶修饰要求的细胞有可能与核移植的要求不兼容［10-11］。

转基因家畜通常采用体细胞为靶细胞经遗传修饰进而克隆生产，而胚胎干细胞则被认为是没有必要的。然而，鼠胚胎干细胞非常适合基因打靶，也可以为移植治疗提供一个体外分化模型。这些有可能是科研工作者仍执著于家畜胚胎干细胞研究的动力所在。大量研究显示，在仓鼠、貂、鼠、鸡、牛、羊、猪和猕猴等众多的物种中都有类胚胎干细胞的存在。然而，目前没有研究解决干细胞生产的嵌合体动物的生殖传递问题。尽管研究者付出了大量的努力，但是生殖胚胎干细胞技术的应用目前仍局限于小鼠。

即使胚胎干细胞的来源不存在问题，但是由胚胎干细胞克隆转基因家畜必须经历嵌合体生产的额外环节，因而有可能面临致命的缺陷。相比之下，通过体细胞克隆在第1代就会获得转基因个体。胚胎干细胞通过嵌合体途径生产转基因动物最大的不利在于其必须检测所有的嵌合体动物以确定其是否拥有生殖传递能力。而体细胞克隆可通过直接在早期检测受体是否受孕即可判定转基因试验的成功与否。

利用胚胎干细胞和体细胞克隆生产转基因动物各有优缺点。研究者可以在核移植过程中对其进行集成并加以利用，从而获得良好效果。目前研究发现，家畜干细胞系与鼠干细胞系的不同之处在于其难以适应单细胞克隆以及基因多次打靶的要求。另外，前期的体细胞核移植结果显示核供体细胞必须处于细胞周期的G0期，这极有可能是因为核供体和受体卵细胞质的细胞循环要有一定兼容性以及在这一状态下核供体基因组更利于重编程［12］。此外，在体细胞发育程序被启动后，其基因表达程序将会被关闭也有可能是细胞处于G0期的一个重要原因。与成纤维细胞不同，胚胎干细胞在任何情况下，甚至是在血清饥饿状态下都不会轻易进入G0期状态。因此，直到目前，有几个重要问题仍处于探索阶段：是否有新的方法使胚胎干细胞有效进入G0期；分化后的胚胎干细胞能否进入细胞G0期；家畜的类胚胎干细胞能否满足基因打靶的要求。

3 动物干细胞及转基因技术在畜牧业领域的应用展望

自“Polly”诞生以来，小鼠、大鼠、牛、山羊等多个物种的体细胞克隆动物相继获得。该项技术无论在基础医学还是在家畜育种研究方面都具有极高的应用价值。影响细胞克隆家畜生产效率的关键因素之一是细胞的选择和筛选［13］。理想的核供体细胞至少应该具备2个方面的特性：较高的增殖能力和细胞核较易被重编程并可获得克隆家畜。随着研究的深入，也遇到了一系列不可避免的问题，如：成体干细胞含量极微，分离和纯化较难；成体干细胞增殖能力弱，而且在一些遗传性疾病中，遗传缺陷也会出现在成体干细胞中。因此，在畜牧业生产实践中，以该种干细胞作为家畜克隆的细胞系是有缺陷的。胚胎干细胞尽管增殖力强，但其面临的无控制性、致瘤和伦理问题限制了它的应用。当前比较普遍使用的核供体细胞是成纤维细胞。利用成纤维细胞作为核供体细胞虽然较易得到克隆家畜，但其生产效率较低，特别是难以满足作为种质资源进行长期储存和规模化生产的需要。同时，多潜能干细胞在疾病的发生和发展过程中所扮演的重要角色长期以来一直被研究者所忽视。干细胞在MHC的表达方面所具有的特性及其在生物进化以及疾病发生方面的作用是值得深入研究的重要课题。

［1］GORDON J W，SCARGOS G A，PLOTKIN D J，et al. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA ［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1980，77（12）：7380-7384.

［2］HAMMER R E，PURSEL V G，REXROAD C E Jr，et al. Production of transgenic rabbits，sheep and pigs by microinjection［J］.Nature，1985，315（6021）：680-683.

［3］EVANS M J，KAUFMAN M H.Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos［J］.Nature，1981，292（5819）：154-156.

［4］MARTIN G R.Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1981，78（12）：7634-7638.

［5］WILMUT I，SCHNEIKE A E，MCWHIR J，et al.Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells［J］.Nature，1997，385（6619）：810-813.

［6］CAMPBELL K H S，MCWHIR J，RITCHIE W A，et al. Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line［J］.Nature，1996，380（6569）：64-66.

［7］SCHNEIKE A E，KIND A J，RITCHIE W A，et al. Human factorⅨ transgenic sheep produced by transfer of nuclei from transfected fetal fibroblasts［J］.Science，1997，278（5346）：2130-2133.

［8］SMITHIES O，GREGG R G，BOGGS S S，et al.Insertion of DNA sequences into the human chromosomal betaglobin locus by homologous recombination［J］.Nature，1985，317（6034）：230-234.

［9］SHESELY E G，KIM H S，SHEHEE W R，etal. Correction of a human bs-globin gene by gene targeting［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1991，88（10）：4294-4298.

［10］WILLIAMS S R，OUSLEY F C，VITEZ L J，et al.Rapid detection of homologous recombinants in nontransformed human cells［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1994，91（25）：11943-11947.

［11］ARBONÉS M L，AUSTIN H A，CAPON D J，et al.Gene targeting in normal somatic cells：inactivation of the interferon-gamma receptor in myoblasts［J］.Nat Genet，1994，6（1）：90-97.

［12］SCHEERER J B，ADAIR G M.Homology dependence of targeted recombination at the Chinese hamster APRT locus［J］.Mol Cell Biol，1994，14（10）：6663-6673.

［13］ITZHAKIJE，GILBERT C S，PORTER A C. Construction by gene targeting in human cells of a "conditional"CDC2 mutant that rereplicates its DNA［J］.Nat Genet，1997，15（5）：258-265.

S813.3；S818.9

A文章顺序编号：1672-5190（2016）09-0105-03

2016－08－10

项目来源：内蒙古农牧业创新基金“蒙古羊机体组织中表达Oct-4、SSEA-1的多潜能干细胞的生物学特性研究”（2016CXJJM04）；国家科技计划项目“特色肉用绵羊种质资源群体选育与利用”（2015BAD 03B0505）；国家转基因重大专项“高品质毛转基因羊新品种培育”（2014ZX08008-004）。

达赖（1979—），男，副研究员，硕士，主要研究方向为动物遗传育种。

（责任编辑：赵俊利）