奶粉中20种磺胺类抗生素含量的外标测定法开发

韦晓群黄维龙黎海超陈俊骐陈燕芬郭庆园李菊蔡纯

（广东出入境检验检疫局广东广州510623）

奶粉中20种磺胺类抗生素含量的外标测定法开发

韦晓群黄维龙黎海超陈俊骐陈燕芬郭庆园李菊蔡纯

（广东出入境检验检疫局广东广州510623）

方法基于液相色谱-质谱串联法，通过优化前处理步骤，提高方法的回收率，达到建立外标法定量的目的。结果显示缓冲溶液的最佳pH为6.5、旋转蒸发温度为35℃，另外只需提取2次以及无需脱脂即能达到满意的回收率。方法的检测限、稳定性能满足奶粉中磺胺类药物的残留检测。

奶粉；磺胺类抗生素；外标法

1 前言

磺胺类药物（Sulfonamides，SAs）是指具有对氨基苯磺酰胺结构的一类药物的总称，具有抗菌谱广、价格低、使用简便、供应充足等优点，目前已广泛用于奶牛传染病的饲养与治疗。由于SAs性质稳定，容易在体内累积以及导致细菌耐药性、过敏、造血紊乱、致癌等，因此，欧盟规定牛奶中SAs的残留限量为10 μg/kg，我国农业部规定牛奶中SAs的残留限量为100 μg/kg。

目前，牛奶中SAs残留的检测方法主要有微生物法（主要为杯碟法，CPM）、紫外可见分光光度法（UV-VIS）、酶联免疫法（ELISA）、气相色谱质谱法（GC-MS）、液相色谱法（LC-PDA）、毛细管电泳法（CE）、薄层色谱法（TLC）、气相色谱-串联质谱法（GC-MS/MS）、液相色谱-质谱串联法（LC-MS/MS）[1-10]。微生物法快速、价低，但特异性差，灵敏度不高，检出限较高；ELISA法特异性好、灵敏度高，但是存在假阳性；GC-MS/MS法需要衍生，前处理步骤繁琐、有机试剂消耗量大；HPLC法分离困难。因而常用的方法是LC-MS/MS法，但是该方法受基质影响大，往往需要添加同位素内标。本研究基于LC-MS/MS法，通过优化前处理步骤，提高方法的回收率，达到外标法定量的目的。方法的检测限、稳定性能满足牛奶和奶粉中SAs的残留检测。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 试剂

混标磺胺脒、磺胺醋酰、磺胺甲氧哒嗪、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲异噁唑噁唑、磺胺二甲苯、磺胺多辛、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺吡啶、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺苯酰、磺胺异二甲嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺甲噁唑、磺胺苯吡唑：由美国西格玛公司提供。

除另有说明外，所用试剂均为分析纯；实验用水采用GB/T 6682规定的二级水。

2.1.2 仪器和设备

三重四级杆-线性离子阱质谱仪（API4000 Q TRAP）：AB SCIEX公司，美国。

2.2 方法

2.2.1 前处理方法

称取0.25 g（精确至0.001 g）奶粉，加入2 mL水，涡旋震荡2 min，加入8 mL乙腈，12 000 r/min离心5 min，过滤；加入10 mL pH=6.5缓冲溶液（20 mmol/L磷酸氢二钾溶液用磷酸调节pH至6.5），震荡2 min；再加入过量氯化钠，离心分层；取出上层清液，再用5 mL乙腈加入到下层清液中洗涤，离心分层并提取上层清液，重复1次。合并上清液，35℃旋蒸至干，用乙腈定容至1 mL，过0.22 μm滤膜于进样瓶中，供上机分析。

2.2.2 色谱条件

色谱柱：Agilent TC C18，150 mm×4.6 mm（i.d.），5 μm；流动相：A为0.1%甲酸溶液，B为乙腈；流速：0.5 mL/min；进样体积：10 μL；柱温：40℃；梯度洗脱：洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

2.2.3 质谱条件

电喷雾离子源；正离子扫描；多重反应检测（MRM）；电喷雾电压：5500 V；雾化器压力：0.065 Mpa；气帘气压力：0.016 Mpa；辅助气压力：0.060 Mpa；离子源温度：45℃；定性离子对、定量离子对、碰撞电压、去簇电压等参数见表2。

表2 定量离子参数

（续表2）

3 结果与讨论

3.1 缓冲溶液pH的优化

比较了缓冲溶液pH分别为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0时对SAs（总量）回收率的影响（图1），结果表明回收率随着缓冲溶液pH的上升而提高，至pH为6.5时达到最高（80%），然后开始下降，因此选择缓冲溶液的pH=6.5。

3.2 提取溶液次数对回收率的影响

比较了用乙腈提取下层溶液次数对SAs（总量）回收率的影响（图2），结果表明提取2次回收率即可达到要求，因此样品前处理时选择提取2次。

3.3 考察正己烷除脂对回收率的影响

比较了是否用正己烷除脂对SAs的影响（图3），结果表明脂质对SAs（总量）的干扰不大，因此不用正己烷除脂。

3.4 旋转蒸发温度对回收率的影响

比较了30℃、35℃、40℃、45℃4个温度对SAs（总量）回收率的影响（图4），结果表明在40℃以上回收率急剧下降，因而选择35℃作用旋转蒸发的温度。

图1 不同缓冲溶液pH下SAs（总量）的回收率

图3 除脂前后SAs的回收率

图2 不同提取次数SAs（总量）的回收率

图4 不同旋转蒸发温度下SAs的回收率

3.5 方法的线性范围、回归方程、相关系数、检出限及定量限

方法对所有SAs的检出限为0.2μg/kg，线性范围为2 μg/kg-100 μg/kg，定量限为2 μg/kg（S/N≥3），详见表3，表示能满足实际检测需求。方法的色谱分离见图5。

表3 检测方法的定量限和定量范围

图5 SAs的色谱-质谱图

3.6 方法的准确度

在0.5 g奶粉里添加5 μg/kg的20种混标溶液1 mL，按制备方法制备后进行测定，测定结果见表4。结果表明SAs（总量）回收率为75.2%-127.1%，相对标准偏差为2.35%-6.81%，满足实验要求。

表4 检测方法的准确度

（续表4）

4 结论

本研究开发了奶粉中SAs的LC-MS/MS外标定量检测方法，结果显示在奶粉的乙腈水溶液中先加入pH为6.5磷酸盐缓冲溶液后加入过量氯化钠，并提取2次，然后在35℃进行旋转蒸发即可得到大于80%的回收率，无需使用同位素内标进行校正。方法的检测限、稳定性能满足奶粉中SAs的残留检测。

参考文献

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[10]农业部1077号公告-1-2008水产品中17种磺胺类及15种喹诺酮类药物残留量的测定，液相色谱-串联质谱法[S].

Development of External Standard Method for the Determination of 20 Kinds of Antibiotics in Milk Powder

WEI Xiaoqun，HUANG Weilong，LI Haichao，CHEN Junqi，CHEN Yanfen，GUO Qingyuan，LI Ju，CAI Chun
（Guangdong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Guangzhou，Guangdong，510623）

The method was developed to improve the recovery rate for achieving external standard method by optimizing the pretreatment steps based on the LC-MS/MS method.The results showed that the optimum pH of the buffer solution was 6.5，the rotary evaporation temperature was 35，which were with twice extraction and without eliminating fat.It was confirmed the detection limit and the stability of the method were satisfied for the determination of sulfonamides in milk powder.

Milk Powder；Sulfonamides；External Standard Method

S859.84

E-mail：weixq@iqtc.cn

广东出入境检验检疫局科研项目（2014GDK62）

2016-09-18