TaqMan荧光定量RT-PCR快速检测腹地病毒方法的建立

沈飚吴刚胡兴娟王忠发滕跃

（舟山出入境检验检疫局浙江舟山316000）

TaqMan荧光定量RT-PCR快速检测腹地病毒方法的建立

沈飚吴刚胡兴娟王忠发*滕跃

（舟山出入境检验检疫局浙江舟山316000）

为建立特异、快速、灵敏的TaqMan荧光定量RT-PCR方法用于腹地病毒核酸检测，利用腹地病毒核衣壳蛋白编码基因的特异性序列设计引物和探针，建立荧光定量RT-PCR快速检测体系。对含有目的基因的质粒、80份发热伴血小板减少综合征病毒阳性血清样本以及80份流行性出血热病毒阳性鼠肺样本进行核酸检测，验证方法的灵敏度、特异度和重复性。结果显示，该方法所检测的80份发热伴血小板减少综合征病毒核酸阳性血清与80份流行性出血热病毒阳性鼠肺样本均为阴性，对目的基因的检测灵敏度达50拷贝/反应；重复性测试中的变异系数为0.09%-0.87%，从样本核酸提取至检测完成的全过程仅需2 h。证明建立的腹地病毒TaqMan实时荧光RT-PCR方法具有快速、特异、灵敏及重复性好的特点，有助于进口货物中昆虫、啮齿类动物、外轮上工作的疑似病人检疫以及对腹地病毒流行病学监测工作的开展。

腹地病毒；发热伴血小板减少综合征；实时荧光RT-PCR

1 前言

发热伴血小板减少综合征（Fever with Thrombocytopenia Syndromes，SFTS）是由两种布尼亚病毒即发热伴血小板减少综合征病毒（Fever with Thrombocytopenia Syndromes Virus，SFTSV）和腹地病毒（Heartland Virus，HRTV）引起的一种急性虫媒传染病[1-3]。该病潜伏期短，死亡率高[4，5]，目前尚无有效疫苗或药物对其进行预防和治疗，因此SFTSV与HRTV已成为全球公共安全威胁。SFTSV流行于中国、韩国、日本等东北亚地区，HRTV流行于美国密苏里、田纳西和俄克拉荷马等美国中部各州。目前，我国虽尚无HRTV感染病例的报道，但存在其流行所需的生态学条件，因此面临HRTV随时输入和流行的威胁。近年来国内对SFTSV的检测研究报道甚多，但对HRTV的检测研究报道甚少，且无商品化试剂供应，一旦疫情输入局面将十分被动。而SFTSV与HRTV在遗传进化上有高度的亲缘性，传播途径与临床症状也十分相似；HRTV的基因组与SFTSV相同均分为L、M、S 3个节段，其中以S节段中的编码核蛋白基因片段（NP）最为保守，是PCR方法研制中的首选靶基因序列。因此积极开展HRTV分子生物学快速诊断技术的研究，可为进出口检疫、疑似病例快速诊断及流行病学监测工作开展奠定技术基础。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 实验仪器

ViiA7型实时荧光定量PCR仪：购自美国ABI公司。

2.1.2 试剂

一步法实时荧光定量RT-PCR试剂盒（RR064A）：购自宝生物工程（大连）有限公司，批号AK6001，有效期2017年7月；HRTV核衣壳蛋白编码基因（NP）特异性序列重組质粒：委托宝生物工程（大连）有限公司构建。

2.1.3 病毒株

80份SFTSV核酸阳性血清：由舟山、宁波、杭州各医院委托本实验室检测，阳性血样进行病毒分离，阳性血清及病毒株由本实验室保存；80份流行性出血热病毒（EHFV）阳性鼠肺：由宁波市疾病预防控制中心馈赠。

2.2 方法

2.2.1 引物与探针设计与合成

根据NCBI已公布的HRTV S基因节段的核酸序列特点，选取核蛋白编码基因（NP）中保守性较高的核酸为靶序列，从GenBank下载Heartland virus isolate patient 1 segment S.complete sequente（JX00 5842.1），选取1455-1558之间的序列作为靶序列，经Blast特异度分析与已公布的HRTV核苷酸序列相似度在98%-100%，而与已知的人DNA序列及其他病毒核苷酸序列无明显的相似度。依照待检靶分子序列设计一条靠近前引物位置1483-1506区间片段与负链互补的荧光标记探针。引物和探针均委托宝生物工程（大连）有限公司合成，序列见表1。

表1 实时荧光定量RT-PCR检测HRTV引物探针序列

2.2.2 重组质粒（定量标准品）的构建

将HRTV核蛋白基因中特异性片段（全长104 bp）进行寡核苷酸合成，合成片段克隆链接到载体pMD19-T上，再导入到工程菌JM109内增殖，重组质粒经测序鉴定确认准确无误。寡核苷酸合成、质粒构建、鉴定及拷贝数量测定均由宝生物工程（大连）有限公司完成。

2.2.3 HRTV实时荧光定量RT-PCR扩增体系与反应条件

总反应体系为25 μL，包括2×One Step RT-PCR Buffer 12.5 μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅡ0.5 μL，EX Taq HS 0.5 μL，ROX ReferenceDyeⅡ0.5 μL，10μmol/L的上、下游引物各0.5μL，5μmol/L的探针0.5 μL，RNase Free 4.5 μL，RNA模版5 μL。反应条件为42℃5min；95℃10s，95℃5s，60℃30 s，45个循环；60℃HEX或VIC通道采集荧光信号。

2.2.4 特异度评估

80份SFTSV阳性血清与80份EHFV阳性鼠肺样本的RNA以及阴性对照与阳性对照进行实时荧光RT-PCR检测，对检测结果进行评估。

2.2.5 灵敏度评估

将标准品重组质粒从5×1010拷贝/μL为起始浓度作10倍梯度稀释至5×100拷贝/μL，取5×107拷贝/μL至5×100拷贝/μL的8个不同浓度标准品进行实时荧光RT-PCR反应，以确定该方法能检出的最低RNA拷贝数量/反应。

2.2.6 重复性评估

选取5×101拷贝/μL-5×106拷贝/μL 6个浓度的标准品重组质粒作为模板，每个浓度模板作3次重复，计算每个浓度Ct值的标准偏差（S）与变异系数（CV）进行统计学分析。

2.2.7 阳性结果判定方法

实时荧光定量RT-PCR检测结果以Ct值<40且扩增曲线呈典型的S型为阳性判定原则。其中，Ct值<35且扩增曲线典型可直接判定为阳性；Ct值在35-40之间的需重复实验，两次实验均能得到典型的扩增曲线可判定为阳性；若有需要建议对这类样本作巢式PCR检测并对扩增产物进行测序予以确认。

3 结果

3.1 方法的扩增体系与反应条件

该方法总反应体系为25 μL，优化后各反应物的终浓度为：校正液（ROX）0.5 μL，Taq酶和逆转录酶各0.5 μL（5 U/μL），模板核酸5 μL，上、下游引物的终浓度0.2 μmol/L，TaqMan探针终浓度0.1 μmol/L，最后用RNase Free水补至25 μL。最佳反应条件为42℃5 min；95℃10 s，95℃5 s，60℃30 s，45个循环；60℃在HEX或VIC通道采集荧光信号。在上述条件下不同浓度的HRTV核酸重组质粒均能获得有规律的典型扩增曲线。

3.2 特异度评价结果

80份SFTSV阳性血清与80份EHFV阳性鼠肺样本，2个不同浓度的HRTV重组质粒（106拷贝/μL与102拷贝/μL）作为HRTV的阳性对照。用建立的实时荧光定量RT-PCR方法同时检测上述样本，观察是否有非特异的扩增现象产生。除了2个浓度HRTV重组质粒出现阳性结果外，其余样本检测结果均为阴性，检测结果显示该方法具有良好的特异性，见图1。

图1 HRTV实时荧光定量RT-PCR检测SFTSV与EHFV的特异度

3.3 灵敏度评估结果

将构建的质粒外标准品稀释成不同浓度，用HRTV实时荧光定量RT-PCR进行灵敏度检测，检测结果显示HRTV重组质粒的灵敏度达到5×101拷贝/反应，7个浓度的扩增曲线呈现典型的S型，见图2。

图2 HRTV荧光定量RT-PCR的检测灵敏度

以重组质粒模板浓度的对数值为横横坐标，循环数（Ct值）为纵坐标作图，得到一条标准曲线，斜率（slop）=-3.397，y-Inter=44.651，相关系数（R2）= 0.999，扩增效率（Eff%）=96.964。检测得到的荧光曲线与所检测的靶基因浓度之间具有良好的相关性，见图3。

图3 HRTV荧光定量RT-PCR的标准曲线

3.4 重复性评估

取5×106拷贝/μL至5×101拷贝/μL的6个浓度外标准品，每个浓度做3个重复试验，计算各重复样本Ct值之间的变异系数与标准差。结果显示从高浓度到低浓度的标准差（S）分布在0.02-0.30，变异系数分布在0.09%-0.87%，该方法具有较好的重复性，见表2。

表2 HRTV实时荧光定量RT-PCR的重复性试验

4 讨论

2009年，在美国密苏里州西北部的2个农场里发生了病毒性出血热，从2个患者的血样中分离出1株新型布尼亚病毒，并命名为HRTV[6]。经序列分析，该病毒与中国发现的SFTSV同属布尼亚病毒科白蛉病毒属，病毒形态与蛋白结构、核酸序列与核酸长度等方面均极为相似。

当前，发热伴血小板减少综合征的发病机理尚不明确，但SFTSV与HRTV均具有泛嗜性，对血液系统、内脏、消化道等都有侵犯，主要临床症状表现为发热、疲乏、腹泻、血小板显著减少、白细胞减少，严重者出现多脏器衰竭而死亡。蜱虫是主要传播媒介，与病人血液接触也可能是其传播途径之一。除人之外，SFTSV与HRTV还可感染牛、羊、猪、鹿、鸡等家畜，造成病毒血症及特异性抗体[7，8]。

随着日益频繁的国际贸易、人员旅游等增加，猪流感、登革热、中东SARS及寨卡等病毒流入我国境内并引起不同规模的流行，HRTV也有可能随着进口农产品中的有害昆虫、易感动物以及旅游人群中的病毒携带者传入我国。目前国内对HRTV检测技术的相关报道唯一可见的是中国CDC对HRTV抗体诊断方法的初步研究[9]，因此建立快速准确的HRTV核酸检测方法作为技术储备，应对今后可能发生的疑似病例早期诊断与有效控制疫情传播具有非常重要的意义。本研究将实时荧光定量RT-PCR技术应用于HRTV核酸的快速检测，能在2 h内（包括RNA提取）完成不同样本的HRTV核酸的实时定量检测，具有高特异度、高灵敏度及较好重复性。虽然目前国内尚无HRTV引起的发热伴血小板减少综合征确诊病例，也无临床阳性血清样本进行校验，但根据既往经验，本研究仍可为完善发热伴血小板减少综合征的检测方法和建立诊断标准提供参考，也可为今后HRTV临床感染的早期诊断和环境中昆虫携带状况的流行病学监测提供技术支持。

5 结论

建立的腹地病毒TaqMan实时荧光RT-PCR方法具有快速、特异、灵敏及重复性好的特点，有助于进口货物中昆虫、啮齿类动物、外轮上工作的疑似病人检疫以及对腹地病毒流行病学监测工作的开展。

[1]Yu X J，Liang M F，Zhang S Y，et al.Fever with thrombocytopenia associated with a novel bunyavirus in China[J].N Engl J Med，2011，364（16）：1523-1532.

[2]Brennan B，Li P，Li A，et al.Reverse genetics system for severe feverwithThrombocytopeniasyndromevirus[J].JVirol，2015，89（6）：3026-3037.

[3]LiuQ，HeB，HuamgSY，etal.severefeverwith Thrombocytopenia syndrome，an emerging tick-borne zoonosis[J]. Lancet infect Dis，2014，14（8）：763-772.

[4]Muehlenbachs A，Fata C R，Lambert A J，et al.Heartland virusassociated death in Tennessee[J].Clin infect Dis，2014，59（6）：845-850.

[5]李德新.发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒概述[J].中华实验和临床病毒学杂志，2011，25（2）：81-84.

[6]Mcmullan L K，Folk S M，Kelly A J，et al.A new phlebovirus associated with severe febrile illness in Missouri[J].N Engl J Med，2012，367（9）：834-841.

[7]宫连凤，姜梅，刘娟，等.山东省烟台市人与动物新型布尼亚病毒感染调查及同源性分析[J].中华流行病学杂志，2014，35（5）：524-527.

[8]Xing Z，Schefers J，Schwabenlander M，et al.Novel bunyavirus indomesticandcaptivefarmedanimals，Minnesota，USA[J]. Emerg Infect Dis，2013，19（9）：1487-1489.

[9]张硕，芜为，张全福，等.Heartland病毒血清学诊断方法的初步建立[J].中国人兽共患病学报，2014，30（5）：444-447.

TaqMan-Based Real-Time RT-PCR Assay for Quick Detection of Heartland Virus

SHEN Biao，WU Gang，HU Xingjuan，WANG Zhongfa*，TENG Yue
（Zhoushan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Zhoushan，Zhejiang，316000）

To establish a specific，rapid and sensitive TaqMan RT-PCR for the detection of Heartland Virus，according to nucleocapsid protein coding genes（NP）specific sequence in Heartland Virus，primers and probe were designed for real-time RT-PCR assay.Sensitivity，specificity and repeatability were tested bydetectingplasmidcontainingthetargetgene，80positiveserumsamplesofFeverwith Thrombocytopenia Syndromes Virus and 80 positive rat lung samples of epidemic hemorrhagic fever virus. Tests showed that plasmid containing the target gene were positive，others negative，and the limitation was 50 copies/reaction.The coefficient of variation in the repeatability test was 0.09%-0.87%，and the whole process from the sample nucleic acid extraction to detection is only 2 hours.This assay was rapid，specific，sensitive and reproducible characteristics，contribute to quarantine of the imported goods in insect，rodent animals，ocean shipping suspected patients and epidemiological surveillance of heartland virus.

Heartland Virus；Fever with Thrombocytopenia Syndromes；Real-Time RT-PCR

R512.8；Q789

E-mail：sb@zs.ziq.gov.cn；通讯作者E-mail：13325807588@163.com

浙江省科技厅公益技术研究社会发展项目（2015C33245）

2016-08-23