肺上皮细胞钙超载在急性呼吸窘迫综合征发生中的机制研究

张可静，李桃红，金雨虹，徐赤裔

肺上皮细胞钙超载在急性呼吸窘迫综合征发生中的机制研究

张可静，李桃红，金雨虹，徐赤裔

目的 细胞水平上阐明钙敏感受体（CaSR）介导的钙超载在急性呼吸窘迫综合征（ARDS）中的可能作用和机制。方法 肺泡上皮细胞系A549细胞在不同脂多糖（LPS）浓度分别以不同时间处理；选择Fluo-4荧光探针检测细胞内钙离子浓度；加入相应的siRNA和混杂对照后，Western blotting测定CaSR蛋白含量。结果 LPS对细胞增殖的抑制作用呈现剂量和时间依赖性。加用LPS后，细胞内的荧光含量增加；siRNA的加入，使得CaSR蛋白含量下降，同时增加的荧光含量也下降，LPS诱发的抑制细胞生长作用被逆转。结论 实验首次发现肺上皮细胞上有CaSR的表达；LPS对肺泡上皮细胞增殖存在影响；CaSR的活化可以抑制细胞的生长。

钙敏感受体；肺上皮细胞；急性呼吸窘迫综合征

急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是临床常见的呼吸系统急危重症，病死率高。目前尚无特效治疗手段，其原因很大程度在于对其发病机制缺乏详细、深入了解。因此，揭示ARDS的发病机制，以及在此基础上，在疾病早期采取有效措施进行防治，已成为进一步提高ARDS治疗效果的关键。以往相关研究更多集中在内皮细胞、肺上皮细胞是否存在钙超载现象，目前尚不清楚。本研究就肺上皮细胞钙敏感受体（CaSR）蛋白表达，与ARDS的关系进行了探讨，报道如下。

1 资料与方法

1.1 材料 A549细胞（ATCC，美国）；脂多糖、单克隆抗肌动蛋白、CaSR（Sigma公司，西班牙）；Fluo-4荧光探针、脂质体-2000（Invitrogen公司，英国）；siRNA，包括混杂对照（Ambion，英国）；CCK-8试剂盒（Dojindo实验室，日本）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 A549细胞以杜尔伯科改良伊格尔培养基（DMEM）培养基（含10%热灭活胎牛血清，100U/ml的青霉素和100g/ml链霉素）保存，在二氧化碳培养箱[1]。培养基1周更换2次，细胞每4～5天以1∶3的比例传代。

1.2.2 细胞处理 A549细胞在不同脂多糖（LPS）浓度（5、10、15 g/ml）处理0、3、6、12和24 h。

1.2.3 细胞活力测定 CCK-8试剂盒测定细胞活力。

1.2.4 细胞内钙离子浓度测定 使用Ca2+指示剂染料Fluo-4，通过荧光显微镜来测定[2-3]。

1.2.5 Western blotting测定 用放射免疫测定缓冲液裂解细胞制备全细胞裂解液，使用蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。Western印迹分析，50 g的每个样本的描述[4]处理。使用下列抗体：抗CaSR和抗actin。二次抗体被耦合到辣根过氧化物酶和化学发光检测。通过扫描光密度分析X线片确定各波段的免疫蛋白的相对含量。

1.2.6 siRNA的转染 细胞在无血清培养基中，被CaSR靶向siRNA（25 nM）转染，时间在6h以上，介质被抽吸，更换成含血清培养基，并且加入转染试剂脂质体-2000至最终浓度2 l/ml[5]，处理24h。

1.3 统计方法 采用SPSS19.0统计软件进行处理。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用ANOVA分析。＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LPS对肺泡上皮细胞增殖的影响 LPS对细胞增殖的抑制作用呈现剂量和时间依赖性。肺泡上皮细胞系 A549细胞 50%抑制浓度的条件是 10g/ml （12 h）。见封三彩图5。

2.2 LPS对细胞内钙离子浓度的影响选择Fluo-4荧光探针检测细胞内钙离子浓度，发现细胞的荧光含量增加。见封三彩图6。

2.3 CaSR活化与钙之间的关系 以LPS（10 g/ml）处理细胞12 h后，蛋白免疫印迹实验中，加CaSR抗体组，在蛋白裂解液中发现了140 kD分子量大小的蛋白条带；加入相应的siRNA和混杂对照后，CaSR蛋白含量下降，同时增加的钙浓度也下降，对照阴性。见封三彩图7。2.4 Western blotting测定CaSR蛋白含量 加入相应的siRNA后，LPS诱发的抑制细胞生长作用被逆转CaSR活化与细胞增殖间的联系。见封三彩图8。

3 讨论

虽然ARDS的发病率和死亡率很高，但是临床治疗手段也在不断进步。研究者的聚焦点主要在于LPS导致的肺炎症反应，且更多关注内皮细胞，作为肺重要组成的上皮细胞，关注甚少。钙是重要的第二信使[6]，掌管多种重要的细胞应答，包括增殖、迁移和细胞因子的分泌。以往研究发现CaSR在管理整体钙的新陈代谢上发挥了关键作用[7-8]。在许多哺乳动物的组织广泛表达，包括一些没有清楚涉及钙新陈代谢的组织[9]。因此，CaSR的活化和多种功能结果相关，包括细胞收缩、增殖、分化和炎症。

本研究发现：LPS的细胞毒效应具有剂量依赖性，伴随细胞内钙离子浓度显著增加。

本研究首次证实，A549细胞有CaSR蛋白的表达，针对性的siRNA片段来抑制CaSR，结果导致CaSR蛋白表达阻滞，并且明显减少了LPS导致的细胞内钙离子的增加。本研还发现：细胞增殖的减少被CaSR-siRNA的出现所抑制，这些结果表明CaSR的活化在LPS引发的肺炎症反应中，扮演了关键角色。

[1] Cortijo J,Milara J,Mata M,et al.Nickel induces intracellular calcium mobilization and pathophysiological responses in human cultured airway epithelial cells[J]. Chem Biol Interact,2010,183(1):25-33.

[2] Wang P,Xu S,Zhao K,et al.Increase in cytosolic calcium maintains plasma membrane integrity through the formation of microtubule ring structure in apoptotic cervical cancer cells induced by trichosan-thin[J].Cell BiolInt,2009,33(11):1149-1154.

[3] Jiang Q,Bai T,Shen S,et al.Increase of cytosolic calcium induced by trichosanth in suppresses cAMP/PKC levels through the inhibition of adenylyl cyclase activity in HeLa cells[J].Mol Biol Rep,2011,38 (4):2863-2868.

[4] Zhao K,Wang W,Guan C,et al.Inhibition of gap junction channel attenuates the migration of breast cancer cells[J].Mol Biol Rep,2012,39:2607-2613.

[5] Justinich CJ,Mak N,PachecoI,et al.The extracellular calcium-sensing receptor(CaSR) on human esophagus and evidence of expression of the CaSR on the esophageal epithelial cell line(HET-1A)[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2008, 294(1):G120-129.

[6] Ward DT.Calcium receptor-mediated in tracellular signaling[J].Cell Calcium, 2004,35(3):217-228.

[7] Chang W,Shoback D.Extracellular Ca2+-sensing receptors--an overview[J].Cell Calcium,2004,35(3):183-196.

[8] Chen RA,Goodman WG.Role of the calcium-sensingreceptor inparathyroid gland physiology[J].Am J Physiol Renal Physiol,2004,286(6):F1005-1011.

[9] Brown EM,MacLeod RJ.Extracellular calcium sensing and extracellular calcium signaling[J].Physiol Rev,2001,81(1): 239-297.

10.3969/j.issn.1671-0800.2016.01.009

R563.8

A

1671-0800(2016)01-0020-02

2015-09-15（本文编辑：孙海儿）

宁波市自然科学基金项目（2009A610175，2014A610248）

315040宁波，宁波市医疗中心李惠利医院

张可静，Email：phyllice@ sohu.com