膀胱癌体内模型研究进展

朱越华 郑昱 聂迪森 秦卫军



·综述·

膀胱癌体内模型研究进展

朱越华 郑昱 聂迪森 秦卫军

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一。在2012年，世界范围内约有430 000例新发病例和165 000例死亡病例[1]。一般情况下，约有70%的非肌层浸润性肿瘤实施局部切除术后再辅助膀胱内的免疫治疗或化疗会有较高的治愈率[2]，但其中约10%～20%的肿瘤会复发并进展为肌层浸润性肿瘤[3-4]，而肌层浸润性膀胱肿瘤患者预后不良，5年生存率较低[5]。由于膀胱癌的高复发率，使得患者不得不接受根治性膀胱切除术，必要时需联合化疗和放疗，降低了生活质量。对于这些膀胱肿瘤患者，疗效的不理想和结果的不可预测性导致临床医生需要寻找可靠的模型来研究和探索新的策略，以提高治疗效果。本文就目前主要的膀胱癌体内模型进行小结。

一、化学致癌剂诱导模型

化学致癌剂诱导模型是利用化学致癌物直接作用于膀胱上皮，模拟膀胱癌产生的病理机制，属于膀胱癌的经典体内模型。1964年首次出现这种方法的报道，是第一种用于评估膀胱癌化疗效果的临床前模型[6-7]。在此之后使用过多种致癌物质作用于不同的物种，包括小鼠、大鼠和狗等，但大多数化学致癌剂诱导模型使用的是N-丁基-N-(4-羟丁基)亚硝胺(BBN)，BBN被认为与人类膀胱癌的产生密切相关，动物通过饮用含有BBN的水而产生膀胱肿瘤，虽然该方法通过全身给药而不是直接作用于膀胱，但膀胱上皮与其他组织相比更容易受到BBN的影响[8-10]。另外，也有通过利用N-甲基亚硝基脲(MNU)进行膀胱灌注，每两周予膀胱灌注MNU溶液0.1 ml(0.2 mg)，共4次，该方法有效建立了膀胱癌模型[11]。

这种模型的优点在于真实模拟了膀胱癌产生的病理过程，相对简单的实现了膀胱内肿瘤的产生。但这种方法的缺点是毒性作用较大，动物死亡可能性高，同时动物对致癌剂的反应不一，不同品系、品种的动物敏感性不同，很难实现特定病理类型的建模。

二、转基因小鼠(genetically-engineered mouse, GEM)模型

尿路上皮被认为是体内更新最慢的上皮之一，体现了其生物转变的特殊背景，致癌基因的激活或抑制的失活被认为是膀胱肿瘤发生的至关重要因素[12]。目前研究与膀胱癌有关的基因有RB1、Ha-ras、CK19-Tag、Nrf-2、p53、Pten、Hras-128、p27、UPⅡ-SV40T等，如p53的缺失与变异可能与膀胱癌发生有关[13-15]。

GEM模型在癌症生物学研究上应用广泛，例如肿瘤表型的分析、信号通路等，是化学致癌剂诱导模型和其他非原位模型的补充[16-17]。传统的GEM模型建立方法是对整个动物进行基因敲除，例如抑癌基因，但这种方法容易造成胚胎的死亡[18]。因此，目前常用的方法是利用Cre/loxp有选择的进行基因插入和敲除，有报道利用Upk2启动子控制下，尿路上皮表达SV40T抗原建立GEM模型[19]。尽管这类模型为研究膀胱癌提供了很好的平台，但也存在如下缺点：第一，缺乏肿瘤的异质性，可能影响肿瘤的进展和转移；第二，与其他癌症相比,膀胱癌在很大程度上是弱势的GEM模型，大多数现有的GEM模型表现为非浸润性，这可能由于多数基因改变，甚至许多组合变化是相对温和的表型，同时阻碍了膀胱癌GEM模型的使用[20]。

三、细胞系移植瘤模型

膀胱肿瘤细胞在免疫缺陷的小鼠或大鼠体内，能够原位移植到膀胱内产生肿瘤，早在1975年就报道过利用膀胱肿瘤细胞移植于膀胱建立膀胱癌模型[21]。目前主要方法是将裸鼠麻醉后，暴露膀胱，利用物理方法损伤膀胱黏膜，将肿瘤细胞悬液灌注膀胱，结扎尿道，2 h后解除结扎，恢复排尿。张琦等[22]使用留置针机械摩擦损伤膀胱黏膜，人膀胱癌细胞悬液暴露的方法建立膀胱癌原位肿瘤模型。也有经尿道插入导管灌入肿瘤细胞的，但由于解剖上的差异，此方法易于在雌性动物上实施，同时延长膀胱灌注的时间有利于提高建模的成功率[23-24]。

虽然这种模型也用于临床前的研究，但由于肿瘤细胞在体外筛选和培养传代，缺乏肿瘤微环境，丢失了原有肿瘤的异质性，导致许多新的治疗方法在临床前研究与临床试验实际疗效之间存在差异。

四、人源性移植瘤(patient derived tumor xenograft, PDTX)模型

PDTX模型被认为是一个能够准确预测标准化疗和肿瘤类型的识别情况的模型，可能使新的治疗方法更好的应用于临床试验中。这个模型的建立是通过使用膀胱癌患者的肿瘤组织直接移植到免疫功能缺陷的动物上，如重度联合免疫缺陷(SCID)鼠或裸鼠。因为它们直接来自患者的肿瘤样本，所以移植后保留了原始肿瘤的细胞结构和分子标志物。因此，膀胱癌PDTX模型具有原始肿瘤的生物学特性并且适用于评价个体患者的肿瘤化学敏感性，这不仅是一个临床试验的平台，更提供了一个潜在的指导临床治疗的决策性工具[25-27]。

膀胱癌PDTX模型对研究肿瘤的生物学特征和评估新的抗癌药物是否可以进入人体临床试验阶段，都具有重要价值。在新药的临床前评价上，最早是使用人类膀胱肿瘤细胞系建立的模型，而膀胱癌PDTX模型只是被用作传统肿瘤模型的补充部分。但是源于细胞系的体内模型由于缺乏原始肿瘤的结构，容易导致肿瘤产生新的特点和亚型，影响新药的疗效，而对膀胱癌PDTX模型而言，患者的肿瘤组织样本经过简单的处理，直接植入小鼠，可以更好地保留原始肿瘤的细胞结构和分子标记[28-29]，提高模型与患者一致性，也使得膀胱癌PDTX模型应用更加广泛。

1.膀胱癌PDTX模型的建立方法：①标本收集：在无菌条件下，切取患者部分(根据肿瘤大小而定)离体肿瘤组织，尽可能选取肿瘤边缘坏死较少的部分组织，将其完全浸泡于4 ℃无血清含双抗的PRMI 1640培养液中。清洗后转移到含培养液的消毒培养皿中(4 ℃)，完全浸泡标本。②移植：用以上培养液清洗肿瘤组织3遍后，用灭菌组织剪将肿瘤组织修剪成1 mm×1 mm×1 mm小块，并与基质胶混匀。麻醉6周龄的雌性SCID鼠或裸鼠，用套管针将肿瘤组织植入到小鼠背侧皮下[30-31]。

2.膀胱癌PDTX模型面临的机遇和挑战：PDTX模型虽然已经建立了几十年，但也是最近才开始用于癌症治疗的评估。目前开发的PDTX人类癌症模型有许多种，如前列腺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、肝癌、结肠癌等，这些模型与原始肿瘤的一致性已经得到广泛认可[32-35]。

保持肿瘤样本的异质性是异种移植的一个优势，它的建立和发展较细胞系移植模型能更好地反映人类肿瘤的特点。然而，异种移植的肿瘤样本不仅包括不同的肿瘤细胞，还包括细胞外基质、免疫细胞、坏死等，这就可能导致不同的肿瘤移植成功率不同，甚至是成功率较低。虽然使用分选的细胞或原代细胞培养可以提高移植的成功率，但由于缺乏原始肿瘤的微环境，使得这些简化的人造肿瘤会影响临床预测的结果。

PDTX模型建立的成功率低以及达到适合药物测试所需模型数量的时间长、缺乏一致性是其主要的局限性。成功植入小鼠是关键的第一步，增加移植小鼠和植入肿瘤组织的数量、多部位移植、加入基质胶等有可能提高成功率。连续的PDTX模型传代是另一重要方面，通过这种方法能达到足够的数量进行药物测试。第一批接受患者肿瘤组织的小鼠数量不是固定的，取决于肿瘤样本的数量，同时应减少使用过细的注射器，这可能会对肿瘤组织的结构造成较大破坏。

PDTX模型的另一个局限性是由于动物的免疫系统和药物代谢途径可能不同于人类，导致小鼠体内的肿瘤反应和临床患者之间的一致性有待评估;同时需要考虑到移植的肿瘤组织所需营养和血液由小鼠供应，可能导致小鼠发生肿瘤转移的概率较小。目前这方面的报道较少，尚需要进一步的研究。

近些年来已有大规模的人类肿瘤PDTX模型项目逐渐开展，但是不同肿瘤组织的预测能力并不一致，例如，模型显示肺癌和卵巢癌有良好的预测价值，但乳腺癌和结肠癌未能得到好的效果[36]。虽然膀胱癌PDTX模型能够保留原始肿瘤的组织学和分子结构，具有很多优势，但是这种模型在临床上的预测价值仍缺乏研究，这也是需要我们继续探索的。

五、总结和展望

随着我国人口老龄化的加剧，膀胱癌的发病率也有所上升，鉴于膀胱癌在治疗上带来的巨大社会经济负担，能够真实反映患者情况的膀胱癌体内模型具有重要的临床价值。本文小结了几种常用的膀胱癌体内模型，各模型之间各有利弊，如何更好地利用这些模型为患者提供有效的个体化治疗方案并降低医疗成本，这需要我们所有科研人员共同努力。

[1] Antoni S, Ferlay J, Soerjomataram I, et al.Bladder Cancer Incidence and Mortality: A Global Overview and Recent Trends[J].Eur Urol,2016.pii: S0302-2838(16)30280-9.doi: 10.1016/j.eururo.2016.06.010.

[2] 王晓天,殷波,宋永胜.TUR-BT术后吉西他滨膀胱灌注联合白介素-2预防非浸润性膀胱癌复发的临床观察[J].现代肿瘤医学,2015,23(3):371-374.

[3] Witjes JA, Dalbagni G, Karnes RJ, et al.The efficacy of BCG TICE and BCG Connaught in a cohort of 2,099 patients with T1G3 non-muscle-invasive bladder cancer[J].Urol Oncol,2016.pii: S1078-1439(16)30114-4.doi: 10.1016/j.urolonc.2016.05.033.

[4] Douglass L, Schoenberg M.The Future of Intravesical Drug Delivery for Non-Muscle Invasive Bladder Cancer[J].Bladder Cancer,2016,2(3):285-292.

[5] Knowles MA.What we could do now: molecular pathology of bladder cancer[J].Mol Pathol,2001,54(4):215-221.

[6] Druckrey H, Preussmann R, Ivankovic S, et al.SELECTIVE INDUCTION OF BLADDER CANCER IN RATS BY DIBUTYL- AND N-BUTYL-N-BUTANOL(4)-NITROSAMINE[J].Z Krebsforsch,1964,66:280-290.

[7] Soloway MS.Single and combination chemotherapy for primary murine bladder cancer[J].Cancer,1975,36(2):333-340.

[8] He Z, Kosinska W, Zhao ZL, et al.Tissue-specific mutagenesis by N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine as the basis for urothelial carcinogenesis[J].Mutat Res,2012,742(1-2):92-95.

[9] Vasconcelos-Nóbrega C, Colaco A, Lopes C, et al.Review: BBN as an urothelial carcinogen[J].In Vivo,2012,26(4):727-739.

[10] 李涛,杨立,王志平.鼠膀胱癌原位模型建立的研究进展[J].现代泌尿生殖肿瘤杂志,2013,5(1):51-53.

[11] 许天源,朱照伟,王先进,等.原位膀胱肿瘤动物模型构建及活体检测体系研究[J].中华实验外科杂志,2015,32(12):3196-3200.

[12] Wu XR.Biology of urothelial tumorigenesis: insights from genetically engineered mice[J].Cancer Metastasis Rev,2009,28(3-4):281-290.

[14] Yang X, La Rosa FG, Genova EE, et al.Simultaneous activation of Kras and inactivation of p53 induces soft tissue sarcoma and bladder urothelial hyperplasia[J].PLoS One,2013,8(9):e74809.

[15] 付阳,熊轶,张古田.原位膀胱癌动物模型建立的研究进展及应用展望[J].东南大学学报:医学版,2015,34(5):832-835.

[16] Abate-Shen C, Pandolfi PP.Effective utilization and appropriate selection of genetically engineered mouse models for translational integration of mouse and human trials[J].Cold Spring Harb Protoc,2013,2013(11).pii: pdb.top078774.doi: 10.1101/pdb.top078774.

[17] Politi K, Pao W.How genetically engineered mouse tumor models provide insights into human cancers[J].J Clin Oncol,2011,29(16):2273-2281.

[18] Capecchi MR.Targeted gene replacement[J].Sci Am,1994,270(3):52-59.

[19] Zhang ZT, Pak J, Shapiro E, et al.Urothelium-specific expression of an oncogene in transgenic mice induced the formation of carcinoma in situ and invasive transitional cell carcinoma[J].Cancer Res,1999,59(14):3512-3517.

[20] 张巧霞,孙小娟,蔡志明.膀胱癌细胞染色质重塑异常与基因组不稳定性研究进展[J].现代泌尿生殖肿瘤杂志,2013,5(2):113-117.

[21] Weldon TE, Soloway MS.Susceptibility of urothelium to neoplastic cellular implantation[J].Urology,1975,5(6):824-827.

[22] 张琦,王珊珊,杨德宣,等.简易肾癌及膀胱癌原位肿瘤模型的建立与应用研究[J].军事医学,2015,39(7):537-540,545.

[23] Smith EB, Schwartz M, Kawamoto H, et al.Antitumor effects of imidazoquinolines in urothelial cell carcinoma of the bladder[J].J Urol,2007,177(6):2347-2351.

[24] 李翀,颜汝平,袁国红,等.荷人膀胱癌原位移植瘤裸小鼠动物模型的建立[J].中华肿瘤杂志,2006,28(10):733-736.

[25] Pavía-Jiménez A, Tcheuyap VT, Brugarolas J.Establishing a human renal cell carcinoma tumorgraft platform for preclinical drug testing[J].Nat Protoc,2014,9(8):1848-1859.

[26] Choi SY, Lin D, Gout PW, et al.Lessons from patient-derived xenografts for better in vitro modeling of human cancer[J].Adv Drug Deli Rev,2014,79-80:222-237.

[27] Cirone P, Andresen CJ, Eswaraka JR, et al.Patient-derived xenografts reveal limits to PI3K/mTOR- and MEK-mediated inhibition of bladder cancer[J].Cancer Chemother Pharmacol,2014,73(3):525-538.

[28] Jung J.Human tumor xenograft models for preclinical assessment of anticancer drug development[J].Toxicol Res,2014,30(1):1-5.

[29] Mohseni MJ, Amanpour S, Muhammadnejad S, et al.Establishment of a patient-derived Wilms' tumor xenograft model: a promising tool for individualized cancer therapy[J].J Pediatri Urol,2014,10(1):123-129.

[30] Park B, Jeong BC, Choi YL, et al.Development and characterization of a bladder cancer xenograft model using patient-derived tumor tissue[J].Cancer Sci,2013,104(5):631-638.

[31] Jin K, Teng L, Shen Y, et al.Patient-derived human tumour tissue xenografts in immunodeficient mice: a systematic review[J].Clin Transl Oncol,2010,12(7):473-480.

[32] Hidalgo M, Bruckheimer E, Rajeshkumar NV, et al.A pilot clinical study of treatment guided by personalized tumorgrafts in patients with advanced cancer[J].Mol Cancer Ther,2011,10(8):1311-1316.

[33] Fichtner I, Slisow W, Gill J, et al.Anticancer drug response and expression of molecular markers in early-passage xenotransplanted colon carcinomas[J].Eur J Cancer,2004,40(2):298-307.

[34] Mischek D, Steinborn R, Petznek H, et al.Molecularly characterised xenograft tumour mouse models: valuable tools for evaluation of new therapeutic strategies for secondary liver cancers[J].J Biomed Biotechnol,2009,2009:437284.

[35] Qu S, Wang K, Xue H, et al.Enhanced anticancer activity of a combination of docetaxel and Aneustat (OMN54) in a patient-derived, advanced prostate cancer tissue xenograft model[J].Mol Oncol,2014,8(2):311-322.

[36] Voskoglou-Nomikos T, Pater J L, Seymour L.Clinical predictive value of the in vitro cell line, human xenograft, and mouse allograft preclinical cancer models[J].Clin Cancer Res,2003,9(11):4227-4239.

(本文编辑：熊钰芬)

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