响应面法优化紫萁多糖提取工艺及体外抗癌活性研究

林 薇,李巧凤,陈 晔,詹寿发

(九江学院药学与生命科学学院,江西九江 332000)

响应面法优化紫萁多糖提取工艺及体外抗癌活性研究

林 薇,李巧凤,陈 晔,詹寿发*

(九江学院药学与生命科学学院,江西九江 332000)

本文意在优化紫萁多糖的提取工艺,并探讨紫萁多糖对癌细胞的作用。以超声-微波协同萃取方法,料液比、微波功率和提取时间为考察因素,在单因素实验的基础上,设计响应面法Box-Benhnken中心组合实验,对紫萁多糖提取工艺参数进行优化,得到优化紫萁多糖的提取条件:料液比1∶35(g/mL),微波功率353 W,提取时间250 s时,紫萁多糖的提取率为0.236%。以体外细胞毒性实验方法研究紫萁多糖对HepG-2癌细胞的抑制作用,当紫萁多糖浓度为0.001 mg/mL时,对HepG-2癌细胞的抑制率为18.13%,在10 mg/mL时抑制率为72.65%,IC50值为0.474 mg/mL。

紫萁,水溶性多糖,响应面法,抑癌率

紫萁(Osmundajaponica)为紫萁科多年生草本蕨类植物,嫩叶干品可食,称为薇菜,含有丰富的维生素、蛋白质、氨基酸[1]、多糖、黄酮、鞣酸[2]、无机盐等多种人体所需营养成分,具清热解毒、润肺理气、补虚舒络、止血、安神、降压、解热之功效[3],主要活性成分是多糖和黄酮类化合物。多糖存在于植物体中,有广泛的生物学活性和功能,如抗衰老、抗菌[4]、降血糖[5]等。人们逐渐认识到植物多糖不仅能作为能量资源和结构材料,更重要的是植物活性多糖参与了生命现象中细胞的各种活动[6],多糖在抗肿瘤[7]、抗病毒、抗辐射方面的作用引起了人们的关注。

国内外学者对紫萁多糖功能活性进行了相关研究,戴金凤、陶海南等[8-9]对紫箕的水溶性多糖进行了提取研究,并运用气相色谱测定了紫萁单糖由葡萄糖、甘露糖、木糖和半乳糖组成,同时也证明紫萁水溶性多糖的抑菌作用是广谱性的,而且紫萁水溶性多糖在抗菌消炎的同时,具有止痛、生肌和护肤等功效;周仁超[10]也证明了紫萁多糖具有一定抑菌活性,特别对金色葡萄球菌和痢疾杆菌抑菌效果明显;许文涛[11]用FARP法测定了紫萁多糖的抗氧化活性,结果表明紫萁多糖具有较好抗氧化活性;此外,Takashi等[12]曾从幼小紫萁叶中提取分离出一种具有血细胞凝集抑制作用的蛋白聚糖,这种蛋白聚糖对血型H有活性。但有关紫萁多糖抗肿瘤活性鲜见报道。

目前,有的学者分别以乙醇、水为溶剂,采用水浴浸提取法进行紫萁多糖提取,提取时间分别为2～6 h,提取温度为90～100 ℃[13-14],该方法提取时间长,提取温度高;张钟等[15]以水为溶剂采用微波辅助提取技术从紫萁中提取多糖,在微波强度为539 W的条件下提取35 s,虽然提取时间较短,但微波功率较高。而超声微波协同提取技术作为一种新兴的样品前处理方法,具有快速、高效、安全、提取时间短[16]、提取效率高[17]、重现性好及目标物损失少等优点,已在天然产物活性成分研究领域广泛应用。有关超声微波协同提取技术在紫萁多糖提取工艺方面研究鲜见报道。本实验以提取时间、微波功率、液料比为实验因素,采用响应面法优化紫萁水溶性多糖的超声-微波协同萃取工艺,并通过细胞毒性实验研究其对HepG-2癌细胞的体外抗癌活性,为紫萁多糖研究与利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

紫萁 2015年6月在江西庐山采集紫萁新鲜植株,太阳下晒干后取紫萁叶在干燥箱中烘干,将干燥的紫萁叶用粉碎机粉碎,过40目筛,贮于密封袋放入冰箱备用;HepG-2细胞 中国科学院生物化学研究所提供;葡萄糖,Sevage试剂[氯仿(V)∶正丁醇(V)=4∶1],3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT) Sigma-Aldrich公司;RPMI 1640培养基和胰蛋白酶-EDTA 基诺生物技术公司;胎牛血清(FBS) 杭州四季青生物工程材料有限公司。

CW-2000超声-微波协同萃取仪 新拓分析仪器科技有限公司;(BSA124S电子天平 赛多利斯科学仪器有限公司;TDL-40B低速台式大容量离心机 上海安亭科学仪器厂;721可见光分光光度计 天津普瑞斯仪器有限公司;AE31倒置生物显微镜 麦克奥迪实业集团有限公司;酶标仪 美国伯腾仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 水溶性紫萁多糖的提取和精制 称取紫萁叶粉末2.00 g(M)加去离子水,使用超声-微波协同提取仪提取紫萁多糖,4000 r/min离心15 min得上清液,加入3倍体积95﹪冰乙醇,置冰箱过夜后4000 r/min离心15 min,沉淀即为紫萁粗多糖。Sevage法脱蛋白2次,将脱蛋白后的多糖溶液按体积比1∶3加入95﹪乙醇溶液,沉淀得紫萁多糖(m)。

1.2.2 水溶性紫萁多糖检测方法

1.2.2.1 葡萄糖标准曲线的制作 采用苯酚-硫酸法测定样品中的多糖[18]。准确称取10 mg经烘干的葡萄糖,用蒸馏水溶解并定容至100 mL(浓度为100 μg/mL)。分别吸取上述溶液0、0.1、0.5、0.9、1.3、1.8 mL加入试管中,每管用蒸馏水定容至2 mL,配制成系列标准葡萄糖溶液,各管加1.0 mL 6%苯酚溶液,再加入浓硫酸5.0 mL,静置10 min,30 ℃水浴15 min,于490 nm处测定各管OD值,以糖含量(μg/mL)为横坐标,OD值为纵坐标绘制标准曲线,得到葡萄糖含量x与吸光度y的回归方程为y=13.088x+0.01885(R2=0.999),表明葡萄糖在10～100 μg/mL质量范围浓度内线性关系良好。

1.2.2.2 紫萁多糖的测定 将脱蛋白后的紫萁多糖用去离子水溶解定容至100 mL,摇匀,从中移取2.5 mL于25 mL容量瓶,加去离子水至刻度。取样液2.0 mL于具塞试管中,加入6%苯酚溶液1.0 mL,再加入浓硫酸5.0 mL,按标准曲线制作相同的方法进行多糖测定,按下式计算样品中紫萁多糖的提取率:

式中:m为提取到的紫萁多糖质量,g;M为紫萁叶粉末的质量,g。

1.2.3 单因素实验 在开启超声波(50 W/40 KHz)的条件下,固定微波功率150 W,料液比1∶20,考察不同提取时间60、120、180、240、300、360 s对紫萁多糖提取率的影响;固定提取时间180 s,料液比1∶20,考察不同微波功率100、150、200、250、300、350 W对紫萁多糖提取率的影响;固定提取时间180 s,微波功率150 W,考察不同料液比1∶20,1∶30,1∶35,1∶40,1∶45,1∶50 g/mL对紫萁多糖提取率的影响。

1.2.4 Box-Benhnken中心组合实验设计 在单因素实验的基础上,采用Box-Benhnken实验设计,以提取时间、微波功率、料液比为自变量,紫萁多糖提取率为响应值,建立紫萁多糖提取工艺条件的二次模型。因素水平见表1:

表1 紫萁多糖提取工艺响应曲面因素和水平

1.2.5 紫萁水溶性多糖抑癌实验

1.2.5.1 紫萁多糖溶液的配置 精密称取250 mg已精制的多糖,溶于10 mL的5%的葡萄糖等渗溶液,涡旋10 min左右,加入10 mL含有胎牛血清和双抗的1640培养液,再加入40 μL(0.2%,v/v)的二甲基亚砜,继续涡旋10 min左右,充分溶解后过0.45 μm水膜,用1640培养液定容到25 mL,即为含10 mg/mL紫萁多糖母液。用1640培养液稀释成0.001、0.01、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2、5、10 mg/mL的系列紫萁多糖溶液(使用时配制)。

1.2.5.2 细胞培养 人肝癌HepG-2细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中,在5% CO2培养箱内37 ℃培养传代,取对数生长期细胞用于实验。

1.2.5.3 MTT法测细胞增殖抑制率 取传代3～4代的对数生长期HepG-2细胞用胰酶消化,洗涤、离心后将其制备成细胞悬液(5.0×104个/mL),取200 μL接种于96孔板中(1.0×104个/孔)。将细胞培养板置于37 ℃细胞培养箱中,在5% CO2条件下孵育24 h,显微镜下观察可见细胞贴壁生长,吸掉培养液,加入浓度分别为0.001、0.01、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2、5、10 mg/mL的紫萁多糖溶液200 μL,以细胞空白和溶剂空白为对照。继续培养48 h后,换无血清的培养液,每孔加入5 mg/mL的MTT 30 μL继续培养4 h后,吸去原培养液,毎孔加入200 μL的DMSO溶解结晶,用酶标仪于570 nm处测定其吸光度,计算不同浓度下的细胞存活率。上述实验,每个浓度设8个复孔,每组重复3次。

式中:A1为实验组吸光度;A2为细胞空白组吸光度;A0为溶剂空白组吸光度。

1.2.6 数据处理 采用Origin7.5软件作图,Design-expert 8.0.6软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 提取时间对多糖提取率的影响 微波功率150 W,料液比1∶20时,随着提取时间的增加,多糖提取率呈现先升高后下降的趋势,图1所示。当提取时间超过240 s时,多糖提取率呈下降趋势,原因可能是时间过长导致多糖水解程度增大,选取提取时间为240 s。

图1 提取时间对对紫萁多糖提取率的影响Fig.1 Effect of extraction time on the yield of polysaccharides of Osmunda japonica

2.1.2 微波功率对多糖提取率的影响 提取时间180 s,料液比1∶20时,随着微波功率的增加,多糖提取率呈现先升高后下降的趋势,图2所示。当微波功率超过350 W时,多糖提取率会下降,原因可能是过高的功率破坏多糖的结构使其分解,造成多糖的损失。另外,过高的功率可能引起爆沸,也引起一定程度的损失,选取微波功率为350 W。

图2 微波功率对紫萁多糖提取率的影响Fig.2 Effect of microwave power on the yield of Polysaccharide from Osmunda japonica

2.1.3 料液比对多糖提取率的影响 提取时间180 s,微波功率150 W时,随着料液比的增加,多糖提取率呈现先升高后下降的趋势,图3所示。当料液比(g/mL)超过1∶35时,多糖提取率会下降,原因可能是随着溶剂用量的增大,出现了暴沸的现象导致不能持续加热,同时部分提取液也会冲上冷凝管造成损失,选取料液比为1∶35。

图3 料液比对紫萁多糖提取率的影响Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on the yield of Polysaccharides from Osmunda japonica

2.2 响应曲面实验结果与分析

2.2.1 响应曲面实验设计及结果 利用Design-Expert V8.0.6软件,采用Box-Behnken设计响应曲面实验方案,以提取时间(A)、微波功率(B)和液料比(C)为自变量,根据单因素实验结果,按表1中的因素、水平进行实验设计,结果见表2。

表2 响应曲面设计与实验结果

表3 拟合二次多项式模型的方差分析

2.2.2 响应曲面分析与优化 响应曲面是优化存在多因素影响实验条件的寻优方法,通过固定数量的实验次数可以连续的对实验因素进行分析,并得到直观的3D曲面图进而评价各因素间的交互作用。根据回归分析的结果,做出模型的响应曲面图,结果如图4～6所示。根据二次模型所做的响应曲面可评价实验因素对紫萁多糖得率的交互作用,以及确定各因素的最佳水平。

图4 微波功率和提取时间对提取率交互影响的三维曲面图Fig.4 Response surface diagram and contour plot for yield of crude Polysaccharides as a function of microware power and extraction time

图5 料液比和提取时间对提取率交互影响的三维曲面图Fig.5 Response surface diagram and contour plot for yield of crude polysaccharides as a function of solid/liquid ratio and extraction time

图6 微波功率和料液比对提取率交互影响的三维曲面图Fig.6 Response surface diagram and contour plot for yield of crude polysaccharides as a function of microware power and solid/liquid ratio

从图4～6中的响应曲面及其等高线可以看出,紫萁多糖提取率受提取时间、微波功率和料液比的共同影响。图4～6所示为当固定提取时间、微波功率、料液比任一因素为为零水平时,其余两个因素间的交互作用及对多糖提取率的影响。紫萁多糖提取率随其中任意两个变量的增加均呈上升趋势,达到某一定值时,曲面稍下降或趋于平缓。其中,提取时间和微波功率的交互作用较大,而微波功率和液料比、液料比和提取时间的交互作用小。

通过对回归模型求解方程,得出紫萁多糖的最佳提取工艺条件为提取时间250.21 s,微波功率353.31 W,料液比1∶35.23(g/mL)。此条件下紫萁多糖最大提取得率的理论计算值为0.243%。

2.2.3 验证实验 为检验实验模型的可靠性,采用上述工艺条件进行紫萁多糖的提取实验,同时考虑到实际操作的可行性,将实验条件定为:提取时间250 s,微波功率为353 W,料液比为1∶35(g/mL),在此条件下提取4次,实际测得的平均提取率为0.236%,与理论预测值相比,相对误差约为0.004%。因此,采用响应曲面法优化得到的提取参数准确可靠,具有实用价值。

2.3 水溶性紫萁多糖抑制癌细胞增殖

统计不同浓度紫萁水溶性多糖溶液培养下的癌细胞存活率及标准差,随着多糖浓度的上升,癌细胞的存活率迅速下降,计算IC50值为0.474 mg/mL,见图7。多糖浓度为0.001 mg/mL时,抑制率为18.13%;当浓度为10 mg/mL时,对癌细胞的抑制率达到72.65%。

图7 紫萁多糖对HepG-2细胞存活率的影响Fig.7 The polysaccharides of Osmunda japonica on HepG-2 effect of cell survival

本实验初步证实紫萁中提取的水溶性多糖具有较强的抗癌活性,但其抗癌作用的机制和免疫活性的机理有待进一步的探索。

3 结论

在单因素实验的基础上,采用Box-Behnken实验,优化得到紫萁水溶性多糖提取的最佳工艺:提取时间250 s、微波功率353 W、料液比1∶35(g/mL)。在此模型下,理论提取率为0.243%,实测提取率为0.236%。与理论预测值相比,相对误差约为0.004%。细胞毒性实验结果显示,随着紫萁多糖浓度的上升,癌细胞的存活率迅速下降,IC50值为0.474 mg/mL。当多糖浓度为0.001 mg/mL时,对18.13%的癌细胞有抑制能力;当浓度为10 mg/mL时,癌细胞的抑制率达到了72.65%,表明紫萁多糖具有较强的抗癌活性,但其抗癌作用的机制和免疫活性的机理还需进一步的探究。

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Optimization of extraction of polysaccharides fromOsmundejaponicaleaves by response surface methodology and their inhibitory effects on tumor

LIN Wei,LI Qiao-feng,CHEN Ye,ZHAN Shou-fa*

(School of Pharmacology and Life Sciences,Jiujiang University,Jiujiang 332000,China)

The study was to explore the optimum processes of extraction polysaccharides fromOsmundajaponicaleaves and the effect of Polysaccharides on cancer cells. Using the ultrasonic microwave synergistic extraction,solid-liquid ratio,microwave power and extraction time as factors,based on the single factor experiment,the response surface methodology(RSM)Box-Benhnken center combination experimental design was employed to optimize the extraction of polysaccharides ofOsmundajaponica. The results of optimum extraction conditions were as follow:the solid-liquid ratio was 1∶35(g/mL),microwave power 353 W,extraction time was 250 s. Under these conditions,the extraction yield was 0.236%. According to the Cytotoxicity test,the inhibitory effect of polysaccharides fromOsmundajaponicaon the HepG-2 cancer cells had been studied. The results of cytotoxicity test indicated that the concentration of polysaccharides were 0.001 mg/mL,10 mg/mL separately,the inhibition rate was 18.13%,72.65% respectively. The vaule of IC50was 0.474 mg/mL.

Osmundajaponica;water-soluble polysaccharides;response surface methodology(RSM);Inhibition rate

2016-05-06

林薇(1995-)，女，本科，研究方向：天然植物的开发与利用，E-mail：artemislyn@163.com。

*通讯作者:詹寿发(1964-)，男，副教授，研究方向：天然植物的开发与利用，E-mail：zhan9630@126.com。

TS

A

1002-0306(2016)24-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.24.000