双水相萃取法分离鱼腥草总黄酮的研究

杨 靖,吕 瑞,邓俊华

(1.中科院成都山地灾害与环境研究所,四川成都 610041;2.绵阳师范学院化学与化学工程学院,四川绵阳 621000)

双水相萃取法分离鱼腥草总黄酮的研究

杨 靖1,吕 瑞2,*,邓俊华2

(1.中科院成都山地灾害与环境研究所,四川成都 610041;2.绵阳师范学院化学与化学工程学院,四川绵阳 621000)

利用聚乙二醇(PEG)-硫酸铵双水相体系对鱼腥草总黄酮进行萃取分离。通过单因素实验分别考察了PEG分子量、两相质量比、萃取温度、萃取pH对分离提取鱼腥草中总黄酮的影响,并用正交实验优化了萃取工艺。经优化后,鱼腥草总黄酮在以mPEG800∶m(NH4)2SO4=2.0∶2.0为双水相体系,萃取pH为3.0,水浴温度为50 ℃时,萃取率可高达98.96%。本方法简单高效,绿色环保,可为鱼腥草总黄酮的高效利用提供参考。

双水相萃取,鱼腥草,总黄酮,正交实验法

鱼腥草(HouttuyniacordataThunb)又名侧耳根、臭草、蕺菜,是三白草科蕺菜属多年生草本植物,是一种集营养、保健、药用功能于一体的药食两用植物,具有抗氧化,抗炎,抗病毒,抗癌等功效[1]。文献记载,鱼腥草中含有大量的黄酮类化合物,如芦丁,槲皮苷,金丝桃苷等[2],鱼腥草的抗癌作用也主要源于其富含的黄酮类化合物[3]。由于黄酮类化合物在人体无法直接合成,因此,如何从植物中提取分离得到黄酮类化合物,成为研究者们关注的问题。

目前,对于鱼腥草中黄酮类化合物分离方法主要有大孔树脂吸附法、聚酰胺吸附法、固相萃取法等[4],其中大孔树脂吸附法因其吸附容量大,速度快,分离效果好而被广泛使用[5-7],但此方法操作繁琐,工业化成本较高。双水相萃取法是利用组分在两个互不相溶的水相中溶解度不同而进行分离的一种新兴萃取技术,其不仅操作简便,萃取条件温和,而且易于工业放大。在天然产物提取分离领域,双水相萃取法已经应用于蒲公英总黄酮[8]、蘑菇多糖[9]、甘草酸[10]、生物碱[11]等活性成分的提取与分离中。但至今尚未见其应用于鱼腥草中黄酮类化合物萃取分离的报道。因此,笔者利用经典的聚乙二醇(PEG)-硫酸铵双水相体系对鱼腥草总黄酮进行萃取分离,并通过正交实验对萃取方案进行了优化筛选,为双水相萃取体系的推广应用以及鱼腥草总黄酮资源的高效开发提供支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鱼腥草 鲜草于2015年3月购于四川绵阳本地市场,经绵阳师范学院天然产物研究中心边清泉教授鉴定为三白草科蕺菜属植物鱼腥草(HouttuyniacordataThunb.)的地上部分;芦丁标准品 中国食品药品检定所,批号:100080-201409,纯度:92.6%;亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、盐酸、无水乙醇、硫酸铵、聚乙二醇(PEG)平均相对分子质量分别为400,600,800,1000,8000 均购自成都科龙化工试剂厂分析纯试剂;实验用水 为二次蒸馏水。

EL-104电子天平 梅特勒托利多仪器有限公司,精度:0.1 mg;HH-S数显恒温水浴锅 金坛市岸头良友实验仪器厂;T6新世纪紫外分光光度计 北京普析通用仪器责任有限公司;SB4200DT超声波清洗机 宁波新芝生物科技有限公司;雷磁PHSJ-4F pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 鱼腥草提取液的制备 将鱼腥草茎叶用二次蒸馏水洗净,于105 ℃鼓风干燥箱中干燥烘干12 h,粉碎后过80目筛。准确称取4.0000 g过筛后样品于锥形瓶中,按料液比1∶25加入100 mL 60%乙醇,充分振荡后于60 ℃下超声萃取45 min,减压抽滤,滤液以60%乙醇定容至100 mL,得鱼腥草提取液。

1.2.2 鱼腥草总黄酮的测定

1.2.2.1 标准曲线的绘制 将20.00 mg芦丁溶解并定容于25.00 mL 60%乙醇溶液中,摇匀得0.8000 mg/mL的芦丁标液。分别准确移取芦丁标液 0.00,1.00,2.00,3.00,4.00,5.00 mL,置于25.00 mL比色管中,加5%亚硝酸钠溶液1.00 mL,摇匀,在室温下放置6 min后再加10%硝酸铝溶液1.00 mL,摇匀并放置6 min,再加入4%氢氧化钠10.00 mL,摇匀,用60%乙醇定容,放置15 min后于510 nm处分别测定各样品的吸光度,以60%乙醇代替芦丁标液做空白对照。以吸光度-浓度作图,得标准曲线。

1.2.2.2 鱼腥草总黄酮的测定 将一定质量的PEG与硫酸铵加入10.0 mL离心管中,加水至8.0 mL,再加入2.0 mL鱼腥草提取液,用橡胶塞塞住管口,充分振荡摇匀后放入恒温水浴锅中,水浴30 min后取出,记下上、下两相体积。分别吸取上、下相溶液于25.00 mL比色管中,按照1.2.2.1项下方法显色后用紫外分光光度计测定各样品的吸光度,以标准曲线得到上、下相浓度。根据下述公式计算黄酮化合物的萃取率:

R=Vup/Vlow

K=Cup/Clow

Y=CupVup/(CupVup+ClowVlow)

式中：R为相体积比,Vup,Vlow分别为上下相体积,K为黄酮类化合物的分配系数,Cup,Clow分别为黄酮类化合物在上下相的浓度,Y为黄酮类化合物的萃取率。

1.2.3 方法可行性 为考察双水相萃取法分离鱼腥草总黄酮的可行性,将2.0 mL鱼腥草提取液和萃取后的上、下相溶液分别置于三支25.00 mL比色管中,按照1.2.2.1项下方法显色后进行紫外光谱扫描。

1.2.4 精密度实验 取2.0 mL鱼腥草提取液,于mPEG400∶m(NH4)2SO4=2.0∶2.0双水相体系中,按照1.2.2项下方法平行实验6次,测定上相溶液中总黄酮浓度,计算RSD。

1.2.5 准确度实验 取9份鱼腥草提取液各2.0 mL,加入不同量的芦丁对照品溶液,于mPEG400∶m(NH4)2SO4=2.0∶2.0双水相体系中,按1.2.2项下方法进行实验,测定上相溶液中总黄酮浓度,并计算方法的加标回收率。

1.2.6 单因素实验设计

1.2.6.1 PEG种类对鱼腥草总黄酮萃取率的影响 按照1.2.2项下方法,分别以PEG400,PEG600,PEG800,PEG1000,PEG8000和硫酸铵组成双水相体系,mPEG∶m(NH4)2SO4为2.0∶2.0,于40 ℃,pH为4.0下进行实验,测定鱼腥草总黄酮在不同条件下的萃取率。

1.2.6.2 温度对鱼腥草总黄酮萃取率的影响 按照1.2.2项下方法,以mPEG400∶m(NH4)2SO4为2.0∶2.0作为双水相体系,控制pH为4.0,分别于30,40,50,60,70 ℃温度下进行实验,测定鱼腥草总黄酮在不同条件下的萃取率。

1.2.6.3 mPEG∶m(NH4)2SO4质量比对鱼腥草总黄酮萃取率的影响 按照1.2.2项下方法,以PEG400和硫酸铵作为双水相体系,分别以mPEG∶m(NH4)2SO4为2.0∶1.8,2.0∶2.0,2.0∶2.2,2.0∶2.4,2.0∶2.6,于40 ℃,pH为4.0下进行实验,测定鱼腥草总黄酮在不同条件下的萃取率。

1.2.6.4 pH对鱼腥草总黄酮萃取率的影响 按照1.2.2项下方法,以mPEG400∶m(NH4)2SO4为2.0∶2.0作为双水相体系,用HCl或NaOH水溶液调节pH,分别在pH为2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,温度为40 ℃的条件下进行实验,并测定鱼腥草总黄酮在不同条件下的萃取率。

1.2.7 正交实验设计 在单因素实验的基础上选择较优条件进行四因素三水平L9(34)的正交实验,优化萃取工艺,因素水平表如表1。

表1 正交实验因素水平表

1.2.8 验证实验 准确称取烘干并粉碎后的鱼腥草150 g于圆底烧瓶中,按料液比1∶25加入60%乙醇,充分振荡后于60 ℃下超声萃取45 min,减压抽滤得鱼腥草提取液。按照1.2.2项下方法分别在正交优化条件和正交表中最优条件下进行验证实验,每个条件下平行实验三次,得平均萃取率。

2 结果与分析

2.1 方法可行性分析

表2 加标回收实验结果

由图1中可知,鱼腥草总黄酮经双水相萃取后,在上相中吸光度明显提高,说明本方法可用于鱼腥草总黄酮的分离。

图1 萃取前后鱼腥草总黄酮的紫外吸收光谱比较Fig.1 The comparison of total flavonoids UV spectrogram before and after extraction

2.2 标准曲线的绘制

扫描紫外光谱得试样的最大吸收波长为510 nm,将1.2.2.1项下溶液依次用紫外分光光度计测其吸光度,以吸光度-浓度作图得标准曲线回归方程为A=3.4215C-0.0007(R2=0.9993),说明在浓度0.03200～0.1600 mg/mL范围内,该标准曲线线性关系良好,可以作为含量测定的标准参照。

2.3 精密度实验

按照1.2.4项下方法进行实验,得上相溶液浓度的RSD为0.22%,说明本方法精密度良好。

2.4 准确度实验

按照1.2.5项下方法进行实验,所得结果见表2。由结果可知,平均回收率为97.48%,RSD均小于1.50%,说明本方法准确度较高。

2.5 单因素实验

2.5.1 PEG种类对鱼腥草总黄酮萃取率的影响 按照1.2.6.1项下方法进行实验,考察PEG种类对萃取率的影响,结果如图2。

图2 不同平均分子量PEG对萃取率的影响曲线图Fig.2 Effect of extraction ratio on average molecular mass of PEG

由图2可知,随着PEG平均分子量的增大,黄酮类化合物的萃取率逐渐减小。研究表明,鱼腥草中的黄酮类化合物主要为黄酮醇类[12],具有一定极性,而随着PEG分子量的增大,其端基数目减小,疏水性增强,因此PEG分子量越大,越不利于鱼腥草中黄酮类化合物的萃取。此外,实验发现随着PEG分子量增大,溶液的黏度也随之增大,导致溶液分相变得困难。因此,在其他条件不变的情况下,PEG平均分子量越小,亲水性越强,鱼腥草总黄酮的萃取率越高,PEG分子量为400时萃取率最高,故选取PEG分子量分别为400,600,800作为正交实验三水平。

2.5.2 温度对鱼腥草总黄酮萃取率的影响 按照1.2.6.2项下方法考察温度对萃取率的影响,结果如图3。

图3 温度对萃取率的影响曲线图Fig.3 Effect of extraction ratio on temperature

由图3可知,当温度由30 ℃递增到70 ℃时,萃取率先升高后降低,在40 ℃时萃取率达到最大,继续升高温度,萃取率反而降低。由于温度对双水相体系的热力学平衡有显著的影响,温度升高会加速相分离的速度,有利于双水相的形成,但升高温度又会增大PEG的溶解度,使得萃取率反而降低[13]。水浴温度为40 ℃时鱼腥草总黄酮的萃取率最高,故选择温度为30,40,50 ℃作为正交实验三水平。

2.5.3 mPEG∶m(NH4)2SO4质量比对鱼腥草总黄酮萃取率的影响 按照1.2.6.3项下方法考察质量比对萃取率的影响,结果如图4。

图4 质量比对萃取率的影响曲线图Fig.4 Effect of extraction ratio on mass ratio of the two phase

在双水相体系中,无机盐的正、负离子在两相间分配系数不同,使得两相间形成电位差,从而影响化合物在两相之间的分配[14]。在本研究中,随着硫酸铵质量的增大,萃取率先增大后减小,这是由于盐浓度的增加,其夺取水分子的能力增强,导致下相体积增大,相比减小,从而影响目标化合物在上相中的分配,且实验发现,硫酸铵质量过大,其在下相中会趋于饱和而进一步析出,不利于确定双水相体系的组分比,两相质量比为2.0∶2.0时鱼腥草总黄酮的萃取率最高。因此,选择2.0∶2.0,2.0∶2.2,2.0∶2.4的质量比作为正交实验三水平。

表4 各因素显著性分析

注:**表示有显著影响,*表示有一定的影响。2.5.4 pH对鱼腥草总黄酮萃取率的影响 按照1.2.6.4项下方法考察pH对萃取率的影响,结果如图5。

图5 pH对萃取率的影响曲线图Fig.5 Effect of extraction ratio on pH value

pH是萃取鱼腥草总黄酮的一个至关重要的参数。pH不同,使得双水相体系中两相的电位差不同,不仅影响上下两相的体积比,也影响各种待分离成分在上下相的分配[15]。本实验发现,整个萃取分离体系应保持弱酸性环境。这是由于,一方面硫酸铵在碱性条件下容易水解,影响双水相体系的稳定性;另一方面,从黄酮类化合物的活性考虑,碱性环境易破坏黄酮的母核结构,使黄酮化合物活性丧失[16]。加之酸性太强体系不易分层。因此,选择pH在2.0到7.0的范围内考察pH对鱼腥草总黄酮萃取率的影响。由图4可以看出,当pH由2.0递增到7.0时,萃取率先升高后降低,在pH为4.0时萃取率达到最大。选择pH为3.0,4.0,5.0作为正交实验三水平。

2.6 正交实验

选取各单因素实验中较优条件进行L9(34)正交实验,正交实验结果见表3,方差分析见表4。

表3 正交实验结果表

从结果可知,9组数据中,A1B1C1D1的萃取率最高,达到99.66%。由正交实验极差(R)可得,影响鱼腥草中黄酮萃取率因素的主次顺序为:质量比(B)>pH(C)>PEG分子量(A)>温度(D)。由此,得到最佳萃取条件为A3B1C1D3,即PEG平均分子量为800,PEG与硫酸铵的质量比为2.0∶2.0,pH为3.0,水浴温度为50 ℃。

在方差分析中,由于温度因素的均方差远小于其他三种因素的均方差,则在该因素影响可以忽略不计时,当作为误差。分析结果表明,PEG与硫酸铵的质量比和pH对鱼腥草总黄酮的萃取率有显著影响,PEG种类对鱼腥草总黄酮萃取率有一定的影响。根据F值可得影响鱼腥草总黄酮萃取率的因素按从大到小的顺序依次为:PEG与硫酸铵的质量比,pH,PEG种类,温度。这与极差分析结果一致。

2.7 验证实验

按1.2.8项方法进行验证实验,得平均萃取率,见表5。

表5 验证实验结果表

由表5可知,在优化后的最佳条件下,鱼腥草提取液中总黄酮的萃取率为98.96%,RSD为0.67%(n=3)。由于该条件下的萃取率略高于实际条件下鱼腥草提取液中总黄酮的萃取率,证明所选条件的合理性,达到了优化的目的。

3 结论与讨论

本研究以PEG-硫酸铵作为双水相体系萃取鱼腥草提取液中的黄酮类化合物,通过单因素实验考察了PEG分子量、两相质量比、萃取温度、萃取pH对萃取率的影响,后采用正交实验优化得到了最佳萃取方案,即以mPEG800∶m(NH4)2SO4=2.0∶2.0作为双水相体系,调节pH为3.0,于50 ℃下水浴30 min,该条件下黄酮类化合物的萃取率能高达98.96%,本方法精密度良好,准确度较高,为鱼腥草总黄酮的提取分离提供了新的参考。

有研究表明[12],鱼腥草中的黄酮类化合物主要为黄酮醇类化合物,包含槲皮素、芦丁、金丝桃苷等,这些化合物中存在共轭体系且为平面型分子,分子间作用力大,在水中的溶解度较小,而PEG作为一种高分子化合物,不仅无毒环保,且与这类化合物具有较好的相容性,因此,本研究选取PEG-硫酸铵作为双水相体系,将鱼腥草中黄酮类化合物富集于PEG相,实现了分离提取。富集后的黄酮类化合物可通过离子交换柱交换、吸附、洗脱后得到,也可使用分子筛,将较低分子量的目标物质留在分子筛内部,而高分子聚合物则随着流动相被洗脱除去,从而得到目标化合物[17]。本方法具有操作简单,条件温和,易于工业放大等优势,可为鱼腥草中黄酮类化合物的提取分离提供新的途径。但本研究在应用过程中,仍存在易乳化,水溶性高聚物粘度较大,回收较为困难等问题。因此,下一步可尝试改用粘度较低、易于挥发的极性有机溶剂-盐体系进行萃取,以解决后期溶剂回收的问题。

[1]孙谦,胡中海,孙志高,等.鱼腥草的生物活性及其机理研究进展[J].食品科学,2014,35(23):354-358.

[2]国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草(上册)[M].上海:上海科学技术出版社,1998:605.

[3]攀宏伟,翟卫,立彦,等.鱼腥草黄酮提取物对肿瘤细胞的抑制作用[J].中国医院药学杂志,2008,28(7):528-531.

[4]赵文国,张丽萍,龚靖,等.鱼腥草中黄酮类化合物提取分离方法的研究进展[J].广东农业科学,2011,38(6):158-159.

[5]Zhang Y,Li S,Wu X,et al. Macroporous resin adsorption for purification of flavonoids in Houttuynia cordata thumb[J]. Chinese Journal of Chemical Engineering,2007,15(6):872-876.

[6]叶春,阚建全,谭书明,等.鱼腥草叶总黄酮的提取分离[J].农业工程学报,2008,24(10):227-232.

[7]李海云,郝再斌,李文兰,等.大孔树脂对鱼腥草总黄酮的吸附分离及其抗氧化作用研究[J].食品研究与开发,2008,29(1):47-51.

[8]杨利民,吕金萍,冯妍.蒲公英总黄酮在聚乙二醇-硫酸铵双水相体系中的分配与提取[J],化工进展,2014,33(8):1992-1996.

[9]吴疆,班立桐.应用双水相萃取技术提取双孢蘑菇多糖的研究[J],食品研究与开发,2011,3(7):4-7.

[10]谢涛,王雯娟,吴如春,等.PEG/(NH4)2SO4双水相体系萃取甘草中的有效成分[J],化学研究与应用,2005,17(2):230-232.

[11]Freire M G,Neves C M S S,Marrucho I M,et al. High-performance extraction of alkaloids using aqueous two-phase systems with ionic liquids[J]. Green Chemistry,2010,12(10):1715-1718.

[12]郭艳华,许江扬.鱼腥草总黄酮的提取纯化及黄酮类型的初步鉴定[J].食品科学,2007,28(9):287-291.

[13]杨利民,吕金萍,冯妍.蒲公英总黄酮在聚乙二醇-硫酸铵双水相体系中的分配与提取[J].化工进展,2014,33(8):1992-1996.

[14]谭志坚,李芬芳,刑健敏.双水相萃取技术在分离、纯化中的应用[J].化工技术与开发,2010,39(8):29-35.

[15]陈俊.双水相萃取技术分离纤维素酶和甘草酸应用研究[D].广西:广西大学,2002:9.

[16]王倩,贾长虹,常丽新,等.双水相萃取法分离纯化狗枣猕猴桃叶总黄酮[J].食品科学,2011,32(16):167-171.

[17]国大亮,朱晓微.双水相萃取法在天然产物纯化中的应用[J].天津药学,2006,18(1):64-67.

Optimization of aqueous two-phase extraction of total flavonoids fromhouttuyniaecordatathunb.

YANG Jing1,LV Rui2,*,DENG Jun-hua2

(1.Institute of Mountain Hazards and Environment,Chinese Academy of Sciences,Chengdu 610041,China; 2.Department of Chemistry and Chemical Engineering,Mianyang Teacher’s College,Mianyang 621000,China)

To separate the total flavonoids fromHouttuyniaecordataThunb by aueous two-phase systems composed of polyethylene glycol(PEG)and phosphate salts,an orthogonal experimental design method was applied to evaluate the influence of the average molecular mass of PEG,mass ratio of the two phases,temperature and pH value on total flavonoids extraction. The extraction rate was achieved 98.96% under the optimal conditions:mPEG400∶m(NH4)2SO4=2.0∶2.0,temperature was 50 ℃,pH was 3.0. The result indicated that,the aqueous two-phase extraction was simple,high quality and environment friendly,and also can apply some useful information for the efficient use of the total flavonoids inHouttuyniaecordataThunb.

aqueous two-phase extraction;HouttuyniaecordataThunb.;total flavonoids;orthogonal experimental method

2016-07-07

杨靖(1985-)女，硕士，实验师，研究方向：化学分析，E-mail:yangjing@imde.ac.cn。

*通讯作者:吕瑞(1986-)女，硕士，讲师，研究方向：中药分离分析，E-mail：renny8160@163.com。

TS201.1

B

1002-0306(2016)24-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.24.000