超声辅助提取菠萝蜜果皮黄酮工艺优化及体外抗氧化活性研究

邓梦琴,林晓瑛,张 明,宋贤良,黄 苇

(华南农业大学食品学院,广东广州 510642)

超声辅助提取菠萝蜜果皮黄酮工艺优化及体外抗氧化活性研究

邓梦琴,林晓瑛,张 明,宋贤良*,黄 苇

(华南农业大学食品学院,广东广州 510642)

采用超声波辅助溶剂法提取菠萝蜜果皮中的黄酮,研究了不同的提取溶剂、提取方式和提取工艺因素(溶剂浓度、料液比、提取时间)对黄酮提取率的影响,采用响应面实验设计和多元二次回归分析优化提取工艺。结果表明,超声辅助溶剂法提取菠萝蜜果皮黄酮的最佳工艺为丙酮浓度61%,料液比1∶25,提取时间24 min,提取温度45 ℃,超声功率300 W。在此条件下进行验证实验,黄酮提取率为6.92%。且该提取条件下得到的黄酮具有良好的抗氧化能力,与VC溶液和BHT溶液相比,其DPPH、·OH自由基清除率IC50值和还原能力大小为:粗提液>VC溶液>BHT溶液。

菠萝蜜果皮,黄酮,提取,抗氧化活性

菠萝蜜是我国南方典型的热带果品之一,含有丰富的蛋白质、糖类、矿物质、维生素等人体所需的营养物质,素有“热带珍果”之称[1]。菠萝蜜果实硕大,产量高,常用以鲜食,味道清甜可口且香气浓郁[2],但采后贮藏期短,果皮、果腱等不可食部分几乎占全果质量的二分之一,在其食用和加工过程中会产生大量的果皮废弃物,造成极大的资源浪费。菠萝蜜果皮富含糖类、果胶、膳食纤维、维生素、矿物质等多种营养成分,以及含有丰富的生物活性物质如多酚、黄酮、活性多糖等[3],邓梦琴等用普通乙醇浸提法提取得到菠萝蜜果皮黄酮提取量为23.51 mg/g[4],与目前其他原料中黄酮类物质提取研究相比,菠萝蜜果皮黄酮含量十分可观,是具有较大潜力的黄酮提取原料。因此,研究菠萝蜜果皮的黄酮提取是菠萝蜜果品深加工及利用的有效途径,对提高果品副产物的综合利用率及其经济效益有重要意义。

黄酮类化合物作为次级代谢产物广泛存在于自然界中[5],大量研究表明,黄酮具有抗氧化、抗菌消炎、抗肿瘤等功效[6-8],作为天然色素、天然抗氧化剂、抗菌剂等已广泛应用于食品工业、药物、化妆品等行业,是近年来天然产物的研究热点之一。而目前关于菠萝蜜果皮中的黄酮类物质研究报道甚少,更多集中在菠萝蜜果肉加工、果酒、果汁[9-11]等加工研究方面。本研究采用超声波辅助溶剂法提取菠萝蜜果皮黄酮,通过响应面法优化提取工艺,旨在突破菠萝蜜深加工利用关键技术缺乏的现状,使果品副产物变废为宝,解决其加工程度低、综合利用率低等问题,以期为以菠萝蜜果皮为物料基础的天然抗氧化剂的开发提供参考依据和技术支持。

表1 超声波辅助提取菠萝蜜果皮黄酮单因素实验

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菠萝蜜皮 购于广州市天平架水果批发市场;芦丁标准品 上海源叶生物科技有限公司;氢氧化钠、氯化钠、氯化铝、亚硝酸钠、丙酮、DPPH等试剂均为分析纯。

KQ-500DE三频式超声波处理机 昆山市超声仪器有限公司;HH-4型恒温水浴锅 常州澳华仪器有限公司;752型紫外可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司;202型电热鼓风干燥箱 广州市富华测控科技有限公司;FW100型万能粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司;H/T16MM台式高速离心机 湖南赫西仪器装备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 提取工艺流程 新鲜果皮清洗→烘干→粉碎→过筛(80目,-4 ℃冷藏备用)→溶剂提取→黄酮粗提液

1.2.2 黄酮含量测定

1.2.2.1 标准曲线绘制 分别取0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL的0.98 mg/mL芦丁标准液于6支10 mL具塞比色管中,加入60%乙醇3 mL,再加入1 mL 5%亚硝酸钠溶液,摇匀,放置6 min后加入1 mL 10%硝酸铝溶液,摇匀,放置6 min后用1 moL/L氢氧化钠溶液定容至10 mL,摇匀,放置15 min后在510 nm处测定吸光值。以芦丁标准液浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线,其回归方程为y=1.0116x-0.008,相关系数R2=0.9995,表明黄酮含量在0～1.0 mg/mL范围内与吸光度呈良好的线性关系。

1.2.2.2 样品含量测定 提取液离心后取上清液稀释10倍,再取1 mL稀释液于10 mL具塞比色管中,按1.2.2.1中步骤测定吸光值,以下方公式计算黄酮提取得率:

式中:c-标曲计算得出的待测液中黄酮质量浓度,mg/mL;v-提取液体积,mL;n-稀释倍数;m-称取菠萝蜜果皮粉末质量,g。

1.2.3 提取溶剂筛选 称取1.000 g菠萝蜜果皮粉末,按1∶10的料液比,分别采用60%乙醇、60%丙酮、60%甲醇、乙酸乙酯、水为提取溶剂,40 ℃下常规浸提2 h,测黄酮得率,选取最佳提取溶剂。

1.2.4 提取方式筛选 称取1.000 g菠萝蜜果皮粉末,按1∶10的料液比,60%丙酮为提取溶剂,分别采用40 ℃下常规浸提1 h、减压加热回流提取1 h、超声波功率300 W下辅助浸提30 min的方法进行提取,提取后的皮渣50 ℃烘干至恒重后,表面喷金,加速电压为10.0 kV,于 4500倍电镜下扫描观察其表面形态,选取最佳提取方式。

1.2.5 单因素实验 称取1.000 g菠萝蜜果皮进行超声波辅助提取,分别考察溶剂浓度、料液比、提取温度、超声波时间和功率对菠萝蜜果皮黄酮提取率的影响,每个水平做三次重复。其单因素实验水平设计见表1。

1.2.6 响应面法优化实验 在单因素实验的基础上,经单因素显著性分析,可选择固定提取温度45 ℃,超声辅助功率300 W,建立3因素3水平的Box-Behnken模型,以丙酮浓度、料液比、提取时间为实验因素,黄酮提取得率为响应值,确定最佳提取工艺。自变量因素编码及水平见表2。

表2 Box-Behnken设计实验因素水平及编码

1.2.7 抗氧化活性测定

1.2.7.1 DPPH自由基清除率 参考陈海光等[12]方法测定。按以下公式计算DPPH自由基清除率:

式中:A0(对照):4.0mLDPPH+0.5mL无水乙醇;A1(反应):4.0mLDPPH+样品溶液;A2(空白):4.0mL无水乙醇+样品溶液。

1.2.7.2 ·OH自由基清除率 采用邻二氮菲-Fe2+氧化法,参考赵艳红等[13]方法测定。按照以下公式计算·OH自由基清除率:

式中:A0:加入H2O2而不加样品时测得的吸光值;A1:未加样品及H2O2时测得的吸光值;A2:加入样品及H2O2时测得的吸光值。

1.2.7.3 还原能力测定 采用普鲁士兰法,参考陈洪璋等[14]方法测定。测得的吸光值越大,还原能力越好。

1.3 数据处理

使用Origin8.5作图,SPSS19.0对数据进行统计分析,DesignExpert8.0Trial软件进行响应面设计与数据处理。

2 结果与分析

2.1 提取方法筛选

由图1和图2可知,采用不同类型的溶剂和不同提取方式分别对菠萝蜜果皮黄酮进行提取,结果表明,以60%丙酮为提取溶剂,黄酮提取率高达5.58%,远高于其他溶剂对菠萝蜜果皮黄酮的提取率,这可能是由于菠萝蜜果皮中黄酮物质的极性与丙酮溶剂有更好的亲和性,因而选择丙酮作为提取溶剂;而对不同提取方式的考察结果可知,超声波辅助溶剂法的黄酮提取率为6.01%,其提取效果远优于传统溶剂提取法的3.08%和溶剂热回流法的4.95%,说明在超声波的空化作用下,黄酮物质与溶剂接触更充分,溶出效果更好,故选择超声波辅助溶剂法为最适提取方式。

图1 不同提取溶剂对菠萝蜜果皮黄酮提取率的影响Fig.1 The effect of different extraction solvents on flavonoids yield of jackfruit peel

图2 不同提取方式对菠萝蜜果皮黄酮提取率的影响Fig.2 The effect of different extraction methods on flavonoids yield of jackfruit peel

通过扫描电镜观察三种不同提取方式下菠萝蜜果皮皮渣的表面形态结构,由图3可看出,经传统溶剂浸提后的菠萝蜜果皮皮渣结块,表面粗糙且孔隙较少,料液不能充分接触渗入;经加热回流和超声辅助提取的菠萝蜜果皮皮渣分散性好,表面凹凸明显,尤以超声波辅助提取的皮渣孔隙最多最深入。这是由于超声波的空化作用引起的强大穿透力所致,表面孔隙能显著提高提取过程的传质速率和效果,加速黄酮溶出,缩短提取时间,验证了超声辅助溶剂提取黄酮的高效性机制。

图3 不同方式提取萝菠蜜皮渣的扫描电镜照片Fig.3 The SEM photos of jackfruit peel for different extraction methods

2.2 提取单因素实验结果分析

2.2.1 丙酮浓度对黄酮提取率的影响 由图4可知,随着丙酮浓度的增加,黄酮提取率呈现先增大后减少的变化趋势,且当丙酮浓度为60%时,黄酮的提取率最高,其原因可能是,当丙酮浓度超过60%时,使得提取粗品中一些低极性杂质等溶出,和黄酮竞争结合丙酮,使有效成分降低,黄酮提取率下降。故选取丙酮浓度为60%。

图4 不同溶剂浓度对黄酮提取率的影响Fig.4 The effect of different solvent concentration on flavonoids yield of jackfruit peel

图5 料液比对黄酮提取率的影响Fig.5 The effect of ratio of material to liquid on flavonoids yield of jackfruit peel

2.2.2 料液比对黄酮提取率的影响 由图5可知,随着料液比的减小,黄酮提取率呈现先增大后减少的变化趋势,且料液比为1∶25时黄酮的提取率最高。这是因为,料液比在一定范围内的减小有利于增加溶剂和原料的接触,增大浓度差,加快溶剂扩散,从而提高黄酮浸出率,当料液比过小时,黄酮溶出量达到饱和,而其他杂质溶出增多,反而降低了黄酮提取率,且不利于节能环保。故选取料液比为1∶25。

2.2.3 超声时间对黄酮提取率的影响 由图6可知,随着提取时间的增加,黄酮提取率呈现先增大后减少的变化趋势,且提取时间为20 min时,黄酮提取率最高。当提取时间超过20 min时,黄酮提取率下降,这可能是长时间暴露物料,使黄酮氧化,其化学结构易遭到破坏,从而降低提取率,且延迟提取时间,还会促进原料中的杂质溶出,降低有效成分,增加能耗、工时等其他成本。故选择超声提取时间为20 min。

图6 超声时间对黄酮提取率的影响Fig.6 The effect of different extraction time on flavonoids yield of jackfruit peel

图7 提取温度对黄酮提取率的影响Fig.7 The effect of different extraction temperatures on flavonoids yield of jackfruit peel

2.2.4 提取温度对黄酮提取率的影响 由图7可看出,提取温度对于黄酮提取率影响不显著,当提取温度为45 ℃时,黄酮提取率略高于其他水平实验组。当65 ℃时提取率由下降趋势转为提高,其原因可能是温度升高,造成丙酮挥发损失及其他成分的溶解度增大,从而影响总黄酮含量的测定,考虑到环保节能和黄酮物质的稳定性,提取温度为45 ℃比较适宜。

2.2.5 超声提取功率对黄酮提取率的影响 图8显示,超声功率对于黄酮提取率影响不显著,当超声功率为300 W时,黄酮提取率略高于其他水平实验组。随着功率增大,超声波对细胞破碎作用增强,利于黄酮溶出;继续增大功率,黄酮溶出达到饱和状态,在超声作用下反而易造成局部高温影响黄酮的稳定性,因此设定超声功率300 W为最佳提取功率。

图8 不同超声功率对黄酮提取率的影响Fig.8 The effect of different ultrasonic power on flavonoids yield of jackfruit peel

2.3 菠萝蜜果皮黄酮提取工艺优化

表3 单因素方差分析

注:**表示p<0.01,极显著;*表示p<0.05,显著;表5同。2.3.1 分析单因素方差分析 利用SPSS 19.0软件对单因素的溶剂浓度(A)、料液比(B)、超声时间(C)、提取温度(D)、超声功率(E)5个因素进行方差分析,由表3可知溶剂浓度、料液比和提取时间在单因素实验中p<0.01,差异极显著;而提取温度和超声功率对黄酮提取率影响不显著(p>0.05),故由单因素方差分析可知,响应面法优化提取工艺可固定提取温度为45 ℃,超声功率为300 W,以溶剂浓度、料液比和超声时间3个因素为自变量,黄酮提取率为响应值Y进行实验。

2.3.2 回归模型的建立及统计检验 响应曲面优化实验结果见表4。采用软件Design Expert 8.0 Trial对所得数据进行回归分析,分析结果见表5。

表4 Box-Behnken实验设计结果

表5 回归模型的方差分析

由表5中数据可知,溶剂浓度和料液比的一次项对黄酮提取率的影响达到显著水平(p<0.05),二次项的影响呈极显著水平(p<0.01);超声时间一次项和二次项均未达到显著水平;各因素的交互项中,A与B交互作用显著,A与C交互作用极显著;由F值可知,各因素对黄酮提取率的影响依次为:料液比(B)>溶剂浓度(A)>超声时间(C);方差分析结果表明,此模型达到极显著水平(p<0.01),失拟项不显著(p=0.2033>0.05),说明该方程拟合良好。因此,各因素值和响应值之间的关系可以用此模型来函数化,此回归方程可对实验结果进行分析预测。通过Design Expert 8.0 Trial软件对表4数据进行非线性回归的二次项拟合后,得到相应的回归方程如下:

Y(%)=6.78+0.15A+0.27B+0.1C+0.25AB-0.3AC-0.028BC-0.58A2-1.44B2-0.1C2

2.3.3 因子交互效应分析 由上述响应面模型绘制响应面分析图。由图9可知,当超声时间一定时,溶剂浓度较高值在50%～70%,料液比在1∶25左右的范围内,随着溶剂浓度和料液比增大,黄酮提取率显著提高,当溶剂浓度大于70%,料液比大于1∶25后,提取率反而降低。表明最佳的溶剂浓度和料液比在设定范围内,且二者交互作用显著。图10表明,在料液比一定时,溶剂浓度高值在50%～70%,增大溶剂浓度,黄酮提取率呈现先逐渐上升最终趋于平缓的变化趋势,保持溶剂浓度不变时,黄酮提取率随超声时间延长而缓慢提高,二者交互作用显著。

图9 溶剂浓度与料液比影响菠萝蜜皮中黄酮提取率的响应面图Fig.9 Response surface for solvent concentration and ratio of material to liquid on flavonoids yield

图10 溶剂浓度与提取时间影响菠萝蜜皮中黄酮提取率的响应面图Fig.10 Response surface for solvent concentration and extraction time on flavonoids yield

2.3.4 最优工艺参数及验证实验 用Design-Expert 8.0软件对二次多项式回归方程进行计算求解,可得菠萝蜜果皮中黄酮提取工艺的优化值为:溶剂浓度61%,料液比1∶24.45,提取时间23.8 min,黄酮提取率为6.81%。为方便实验操作,将提取工艺的最佳参数取整,即丙酮浓度61%,料液比1∶25,提取时间24 min,提取温度45 ℃,超声功率300 W,此条件下的验证实验,黄酮提取率为6.92%(单因素实验与优化实验所用菠萝蜜非同一批次,由于菠萝蜜有季节性,而且同一个品种的菠萝蜜不同成熟度黄酮含量也有所差异,优化实验所用菠萝蜜皮的黄酮含量本身就比单因素实验的偏低,所以导致优化后的黄酮提取率比单因素实验低。),与理论预测值的相对误差为1.55%,表明该响应面预测模型可靠。

2.4 抗氧化活性评价

采用DPPH、·OH自由基清除率和还原能力为指标来综合评价黄酮粗提液的体外抗氧化活性,以VC溶液和BHT溶液为对照,结果如表6至表8所示。

IC50值是指自由基清除率为50%时,抗氧化剂的浓度值,IC50值越小抗氧化能力越好。由表6可以看出,粗提液与VC的DPPH自由基清除率IC50值几乎相等,表明粗提液对DPPH自由基的清除效果和VC相当,具有良好的DPPH自由基清除能力。由表7可知,样品提取液的·OH自由基清除率的IC50值小于BHT,即二者清除·OH自由基能力为:提取液>BHT。由表8可知,同等浓度下粗提液和VC溶液,二者的还原能力的吸光值:粗提液>VC溶液,即提取液的还原能力要优于同浓度下的VC溶液。综合上述分析不难看出,经响应面法优化的提取工艺所提取的黄酮粗提液有优于VC和BHT的体外抗氧化活性。

表6 提取液和VC的DPPH自由基清除率IC50值比较

表7 提取液和BHT的·OH自由基清除率IC50值比较

表8 提取液和同浓度下的VC还原能力比较

3 结论

本研究采用超声波辅助溶剂提取法提取菠萝蜜果皮中的黄酮类物质,分别考察各单因素对黄酮提取率的影响并通过响应面对提取工艺进行优化,得到各因素对黄酮提取率影响程度大小为:溶剂浓度>料液比>超声时间>提取温度>超声功率,并优化得到最佳提取工艺为:丙酮浓度61%,料液比1∶25,提取时间24 min,提取温度45 ℃,超声功率300 W。在此条件下进行验证实验,黄酮提取率高达6.92%;

比较粗提液、VC溶液和BHT溶液的DPPH、·OH自由基清除率IC50值和还原能力,得出抗氧化活性大小为:粗提液>VC溶液>BHT,表明菠萝蜜果皮黄酮粗提液具有良好的体外抗氧化活性,值得进一步研究和开发。

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Studies on ultrasonic assisted extraction and antioxidant function of flavones from the peels ofArtocarpusheterophyllusLam

DENG Meng-qin,LIN Xiao-ying,ZHANG Ming,SONG Xian-liang*,HUANG Wei

(College of Food Science,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China)

Flavonoids was extracted from jackfruit peel by ultrasonic assisted solvent extraction method and the effects of different extraction solvents and extraction methods on the extraction rate of flavonoids were studied. At the same time,the effect of solvent concentration,ratio of material to liquid and extraction time on the yield of flavonoids from jackfruit peel were studied and the extraction process was optimized by the response surface experiment design. Results showed that the optimum extraction conditions were 61% solvent concentration,solid-liquid ratio 1∶25,extraction time 24 min,extraction temperature of 45 ℃,ultrasonic power 300 W.Under these conditions,the extraction rate of flavonoids could reach up to 6.9213% with a significant antioxidant ability. Moreover,the scavenging capacity of DPPH and OH free radical value(IC50)was ordered as follows:crude extract>VCsolution>BHT solution,as well as the reduction ability compared with the VCsolution and BHT solution.

jackfruit peel;flavonoids;extraction;antioxidant activity

2016-06-17

邓梦琴(1991-)，女，硕士，研究方向：食品加工，E-mail：dmq503592509@163.com。

*通讯作者:宋贤良(1969-)，男，副教授，主要从事食品加工新技术的研究，E-mail:songxl2000@163.com。

公益性行业(农业)科研专项(201303077)。

TS209

A

1002-0306(2016)24-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.24.000