响应面法优化短梗五加总皂苷的超声提取工艺

李 健,谢 晶,刘 宁,李廷利

(1.哈尔滨商业大学食品工程学院,黑龙江哈尔滨 150076;2.黑龙江中医药大学药学院,黑龙江哈尔滨 150040)

响应面法优化短梗五加总皂苷的超声提取工艺

李 健1,谢 晶1,刘 宁1,李廷利2

(1.哈尔滨商业大学食品工程学院,黑龙江哈尔滨 150076;2.黑龙江中医药大学药学院,黑龙江哈尔滨 150040)

以短梗五加茎为原料,采用超声波辅助提取短梗五加中总皂苷。研究料液比、乙醇体积分数、超声时间、超声功率四个因素对短梗五加中总皂苷提取效果的影响,在单因素实验的基础上,采用Box-Behnken Design实验,以总皂苷得率为响应值,建立回归模型并由此得出四个因素最优提取工艺组合为:料液比1∶50,乙醇体积分数68%,超声时间41 min,超声功率350 W,此条件下短梗五加总皂苷的得率为1.577%。实验真实值与模型预测值1.586%基本一致,表明响应面中心组合法合理可行,可以优化提取短梗五加总皂苷的工艺。

短梗五加,总皂苷,超声提取,响应面法

短梗五加(Acanthopanaxsessiliflorus)又称无梗五加,为伞形目五加科五加属,药食两用植物。主要分布于中国东北、河北、山西、朝鲜及俄罗斯远东地区[1]。《本草纲目》中写道:“五加治风湿痿痹,壮筋骨,其功良深,仙家所述,虽若过情,盖奖辞多溢”[2]。

在我国东北地区,将短梗五加当刺五加药用,未见不良反应报道[3]。短梗五加含有丰富的三萜皂苷类、木脂素类、香豆素类、多糖类、微量元素和氨基酸等多种化合物[4-8]。短梗五加性温,无毒,平衡阴阳,补肾强腰、益气安神、活血通络[9]。

有研究称,短梗五加可显著延长异戊巴比妥钠诱导的小鼠及大鼠睡眠时间,改善睡眠质量[10]。还有多种食用功效如抗炎镇痛、提高免疫、抗肿瘤、抗血栓、抗血小板凝集等作用[11-12]。短梗五加作为山野菜食用已有几千年历史,既是药食同源食品,也是新型保健食品的优质原料。

目前从短梗五加中提取皂苷类物质的研究较少,本实验采用超声辅助提取短梗五加总皂苷的方法,在此基础上应用响应面法对提取工艺参数进行优化,为工业上提取短梗五加总皂苷提供方便、快捷并安全有效的方法,为合理利用新资源食品短梗五加提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

短梗五加茎 购于辽宁丹东五加高新农业科技开发有限公司;人参皂苷Re标准品(纯度98%) 中国食品药品检定研究院;无水乙醇(分析纯)、冰醋酸 天津市永大化学试剂厂;高氯酸 天津政成化学制品有限公司;香草醛 天津市精细化工研究所。

HC-7P11-5型架盘药物天平 上海精科科技有限公司;DHG-9123A型电热恒温鼓风干燥箱 上海恒科有限公司;UV5100B型紫外可见分光光度计 上海元析仪器有限公司。DEF-500型500 g摇摆式高速万能粉碎机 温岭市林大机械有限公司;KQ-500VDED双频数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;FA2004B型电子天平 上海越平科学仪器有限公司;TU-1901双光束紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;TDL-4A离心机 上海菲恰尔分析仪器有限公司;HWS24型电热恒温水浴锅 上海一恒科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 短梗五加总皂苷的提取 短梗五加根茎,60 ℃烘干,粉碎过45目筛,石油醚脱脂,在一定料液比、乙醇浓度等条件下进行超声提取[13-14],过滤后滤液减压浓缩,用水饱和正丁醇溶液萃取过夜;分离出正丁醇相,经减压浓缩、真空干燥后得短梗五加总皂苷。

1.2.2 标准曲线的绘制 精确称取干燥至恒重的人参皂苷Re标准品10 mg,甲醇溶解定容至100 mL,配制成0.1 mg/mL的溶液,即为人参皂苷Re标准溶液。

取人参皂苷Re标准溶液,在300～700 nm波长范围内进行扫描,确定人参皂苷Re对照溶液最大吸收峰。

精密吸取标准溶液0、0.30、0.60、0.90、1.20、1.50、1.80 mL于100 mL小烧杯中,水浴挥去溶剂,加入0.2 mL 5%的香草醛-冰醋酸溶液,0.8 mL高氯酸,于60 ℃水浴加热15 min,取出流水冷却,加5 mL冰醋酸,摇匀,静置20 min,以去除人参皂苷的溶液随行空白,在545 nm处测吸光值。以浓度(mg/mL)为横坐标,吸光值为纵坐标,绘制标准曲线,得到线性回归方程。

1.2.3 短梗五加总皂苷含量测定及计算得率 准确称取短梗五加样品0.5 g于小烧杯中,加入一定浓度乙醇溶液,超声辅助提取后,将提取液离心,乙醇定容至50 mL。准确吸取1 mL于100 mL烧杯内,其余步骤与标准曲线的制作方法中水浴挥干溶剂项下的相同,用紫外分光光度法测其吸光值A,总皂苷得率计算见公式(1)。

式(1)

式中:Y-短梗五加总皂苷得率,%;c-皂苷质量浓度,mg/mL;N-稀释倍数;m-短梗五加粉末质量,g。

1.2.4 单因素实验 选取料液比、超声功率、超声时间、乙醇体积分数四个单因素,确定其适宜的范围,平行实验三次,取平均值。

1.2.4.1 不同料液比对总皂苷得率的影响 准确称取短梗五加粉0.50 g,料液比分别为1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 mL,在温度为40 ℃,超声功率为400 W,乙醇体积分数为70%的条件下超声30 min。测定方法同按1.2.3中所述,按公式(1)计算得率。

1.2.4.2 不同超声功率对总皂苷得率的影响 准确称取短梗五加粉0.50 g,超声功率分别为300、350、400、450、500 W,在温度为40℃、液料比为1∶50,乙醇体积分数为70%的条件下超声30 min。测定方法同按1.2.3中所述,按公式(1)计算得率。

1.2.4.3 不同超声时间对总皂苷得率的影响 准确称取短梗五加粉0.50 g,超声时间分别为20、30、40、50、60 min,在温度为40℃、功率为350 W,料液比为1∶50,乙醇体积分数为70%的条件下。测定方法同按1.2.3中所述,按公式(1)计算得率。

1.2.4.4 不同乙醇浓度对总皂苷得率的影响 准确称取短梗五加粉0.50 g,乙醇体积分数分别为50%、60%、70%、80%、90%,在温度为40℃、超声功率为350 W,料液比为1∶50的条件下超声40 min。测定方法同按1.2.3中所述,按公式(1)计算得率。

1.2.5 Box-Behnken实验设计确定最优提取条件 综合单因素实验结果,根据Box-Behnken的中心组合实验设计原理[15],在四因素三水平上,根据响应面结果确定短梗五加总皂苷的提取工艺,因素水平设计见表1。

表1 响应面实验设计表

1.3 数据处理

采用Excel 2003分析数据,计算标准误差并制图,各提取条件平行测定3次,p<0.05有统计学意义。通过Design Expert 7.0.0软件对短梗五加总皂苷的提取条件进行优化。

2 结果与分析

2.1 最大吸收波长的确定及标准曲线的绘制

人参皂苷Re标准品甲醇溶液在545 nm波长下有最大吸光值,即人参皂苷Re标准品溶液的λmax=545 nm。详见图1。

图1 人参皂苷Re标准品光谱扫描曲线Fig.1 Standard alcohol solution of ginseng saponin Re

人参皂苷Re含量与其在545 nm波长下的吸光值之间有较好的线性关系,见图2。

图2 人参皂苷Re标准曲线Fig.2 Standard curve of ginseng saponin Re

当人参皂苷Re的浓度为0～0.03 mg/mL范围时,得到的线性回归方程为Y=31.82X+0.005(R2=0.9993)。

2.2 单因素实验

2.2.1 料液比对短梗五加中总皂苷得率的影响 由图3可知,在料液比为1∶20～1∶50 g/mL之间时,总皂苷得率随料液比的增加而明显增大,在1∶50 g/mL处达到最大值,在料液比为1∶60 g/mL时提取率反而下降,这可能由于液料比为1∶50 g/mL时皂苷溶解达到最大值,但随着提取液增加皂苷溶解已达到饱和,其他非皂苷类成分随之溶出。故增加溶剂用量并不能提高提取率,因此料液比应选择在1∶50 g/mL时较为合适。

图3 料液比对短梗五加总皂苷得率的影响Fig.3 Effect of ratio of material to liquid on the yield of total saponin

2.2.2 超声功率对短梗五加总皂苷得率的影响 由图4可知,在超声功率为300～350 W之间时,总皂苷得率随着超声功率的增加而逐渐增大,在350W处达到最大值,在超声功率350 W之后随超声功率增加得率反而下降。这可能由于随着超声功率增加,提取温度随之上升,由超声功率引发的机械剪切力的增大及瞬间高温会破坏皂苷类物质结构。因此提取时最适超声功率为350 W。

图4 超声功率对短梗五加总皂苷得率的影响Fig.4 Effects of ultrasonic power on the yield of total saponin

2.2.3 超声时间对短梗五加总皂苷得率的影响 由图5可知,在超声时间为20～40 min之间时,总皂苷得率随着超声提取时间的延长而逐渐增大,在40 min处达到最大值,在超声时间40 min后随超声时间延长得率反而下降。这可能由于长时间超声波处理,非皂苷类物质溶出增加和已溶出的皂苷发生分解,故适宜的超声时间为40 min。

图5 超声时间对短梗五加总皂苷得率的影响Fig.5 Effects of ultrasonic time on the yield of total saponin

图6 乙醇体积分数对短梗五加总皂苷得率的影响Fig.6 Effects of ethanol concentration on the yield of total saponin

2.2.4 乙醇体积分数对短梗五加总皂苷得率的影响 图6可知,在乙醇体

表2 响应面分析设计及结果

表3 回归方程系数及显著性检测

注:*:p<0.05,差异显著;**:p<0.01,差异极显著。积分数为50%～70%之间时,总皂苷得率随乙醇体积分数的增加而明显增大,在70%处达到最大值,后随乙醇体积分数增加而下降。这是由于随着乙醇体积分数增大抑制乙醇向物料渗透,影响皂苷浸出,当乙醇体积分数为70%时皂苷最大程度地溶出,故选取乙醇体积分数为70%。

2.3 响应面法分析设计

2.3.1 响应面实验结果与分析 应用Box-Benhnken实验设计,选择料液比、乙醇体积分数、超声时间、超声功率为考察因素,以总皂苷得率为响应值,优化最佳工艺参数,实验结果见表2,方差分析结果见表3。

由上述响应面设计结果和回归模型的方差分析得到因素交互作用的响应曲面图。以总皂苷得率为响应值,提取工艺各因素经二次回归拟合后,得到回归方程为:皂苷得率=1.220-0.012A+0.010B+0.002833C+0.004917D+0.001750AB+0.016AC+0.073AD+0.016BC-0.022BD-0.001000CD-0.21A2-0.23B2-0.25C2-0.22D2

由图7可以看出,乙醇体积分数保持在70%时,总皂苷得率随料液比增加而增加,当料液比为1∶50时,总皂苷得率最大,随料液比继续增加得率开始降低。图8可以看出,由超声功率和乙醇体积分数交互作用的等高线可知,沿乙醇体积分数轴向等高线比沿超声功率轴向密集,且等高线呈椭圆形,说明两因素交互作用较强,影响显著[16]。图9可以看出,乙醇体积分数曲面较超声时间曲面陡峭,说明乙醇体积分数对响应值的影响比超声时间影响显著,随着超声时间和乙醇体积分数的增加响应值先增大后减小。图10可以看出,由超声功率和料液比交互作用的等高线可知,沿料液比轴向等高线比沿超声功率轴向密集,且等高线呈椭圆形,说明两因素交互作用较强,影响显著。图11可以看出,超声时间和料液比交互作用的响应曲面图均较陡峭,由二者等高线可以看出沿料液比轴向等高线更密集,说明料液比对响应值的影响比超声时间影响显著。图12可以看出,超声功率与超声时间交互作用的响应曲面图,沿超声时间轴向等高线比沿超声功率轴向更密集,说明超声时间对响应值的影响比超声功率影响显著。通过此种方法也可以看出B(乙醇体积分数)>A(料液比)>C(超声时间)>D(超声功率),与回归分析结果一致。

图7 乙醇体积分数与料液比的响应曲面图Fig.7 Response surface figures of material to liquid ratio and ethanol concentration

图8 超声功率与乙醇体积分数的响应曲面图Fig.8 Response surface figures of ultrasonic power and ethanol concentration

图9 超声时间与乙醇体积分数的响应曲面图Fig.9 Response surface figures of ultrasonic time and ethanol concentration

图10 超声功率与料液比的响应曲面图Fig.10 Response surface figures of ultrasonic power and material to liquid ratio

图11 超声时间与料液比的响应曲面图Fig.11 Response surface figures of ultrasonic time and material to liquid ratio

图12 超声功率与超声时间的响应曲面图Fig.12 Response surface figures of ultrasonic power and ultrasonic time

通过软件分析确定最佳提取工艺条件为乙醇体积分数为67.96%,料液比为1∶50.69 g/mL,超声功率为346.10 W,超声时间为40.84 min,该条件下短梗五加总皂苷得率理论值1.586%。根据实际操作情况将提取条件改为乙醇体积分数为68%,料液比为1∶50 g/mL,超声功率为350 W,超声时间为41 min,在此条件下平行3次进行验证实验。得总皂苷平均得率为1.577%,与预测值偏差不大,且测定结果稳定,说明响应面模型与实际情况拟合良好。因此,该结果合理可靠。

3 结论

采用超声辅助有机溶剂提取短梗五加总皂苷,通过单因素实验和响应面法分析优化短梗五加总皂苷的最佳提取工艺参数,得出最佳提取工艺为乙醇浓度为68%,料液比为1∶50 g/mL,超声功率为350 W,超声时间为41 min,此时短梗五加总皂苷的提取率为1.577%。同时超声波辅助提取法省时、低能耗、成本低、效果好,工艺简单,易于商业化生产,为更好开发利用短梗五加总皂苷提供参考和依据。

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Optimization of ultrasonic-assisted extraction of total saponin fromAcanthopanaxsessiliflorususing response surface methodology

LI Jian1,XIE Jing1,LIU Ning1,LI Ting-li2

(1.College of Food Engineering,Harbin University of Commerce,Harbin 150076,China; 2.College of Pharmacy,Heilongjiang University Of Chinese Medicine,Harbin 150040,China)

The root stem ofAcanthopanaxsessiliflorus(Rupr. et Maxim.)Seem was used as the raw material,ultrasonic assisted extraction of total saponins fromAcanthopanaxsessiliflorus. The effect of material-to-liquid ratio,ethanol concentration,ultrasonic time,ultrasonic power on the extraction result of the total saponin ofAcanthopanaxsessilifloruswas studied. On the basis of single factor experiment,Box-Behnken Design is applied to build a regression model,with the yield rate of total saponin as response value. Establish regression model and according to this,the optimal extraction combination was follows:material-to-liquid ratio 1∶50,ethanol concentration 68%,ultrasonic time 41 min,ultrasonic power 350 W. In this condition,the yield of the total saponin is 1.577%. The true value of the experiment accords with the predictive value of the model was 1.586%,show that response surface center combination method is reasonable and feasible,which can optimize the extraction process of total saponins fromAcanthopanaxsessiliflorus.

Acanthopanaxsessiliflorus;total saponin;ultrasonic extraction;response surface methodology

2016-05-20

李健(1956-),男,学士,教授,研究方向:食品科学,E-mail:lijian4852147@163.com。

国家自然科学基金面上项目(81274114)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)24-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.24.000