10株乳酸杆菌吸附铅离子及抗氧化能力的比较

于上富,靳 妲,丁秀云,徐 敏,霍贵成

(东北农业大学食品学院,乳品科学教育部重点实验室,黑龙江哈尔滨 150030)

10株乳酸杆菌吸附铅离子及抗氧化能力的比较

于上富,靳 妲,丁秀云,徐 敏,霍贵成*

(东北农业大学食品学院,乳品科学教育部重点实验室,黑龙江哈尔滨 150030)

为了筛选出高吸附铅离子且具高抗氧化能力的菌株,本文对10株乳杆菌进行了铅离子吸附研究,以DPPH清除力、还原能力、羟自由基清除及抗脂质过氧化能力为指标进行了体外抗氧化能力的评定。研究结果表明:不同乳杆菌之间的清除铅离子能力不同,抗氧化能力也不相同,其中德式乳杆菌保加利亚亚种KLDS1.0207具有高吸附铅离子和高抗氧化能力,该菌株铅离子去除率达79.18%,还原能力达99.00 μmol/L的半胱氨酸当量,清除DPPH率为50.40%,清除羟自由基26.88%,抗脂质过氧化能力达15.62%。此菌株可用于体内缓解铅中毒造成的氧化损伤的研究。

氧化损伤,乳杆菌,抗氧化性,生物吸附

铅是一种具有神经毒性的重金属元素,是人体非必需元素,广泛存在于工作环境和生活环境中[1],如,化妆品、油漆、汽油、水管、玩具、餐具等[2-3]。长期暴露可以逐渐增加机体对铅的吸收,造成人和动物机体的一些功能障碍[4-5]。已有研究报道,铅对人体产生氧化损伤[6-8],导致神经紊乱[9]以及对肾脏、造血、消化等系统产生影响。其中,铅可以影响肾小管的上皮细胞的线粒体的功能,抑制ATP酶的活性,破坏线粒体膜的通透性等。这些都可以促使脂质过氧化的发生,诱导机体产生活性氧、自由基等,超出自身的氧化系统的调节,从而引起组织的氧化应激和炎症的发生。为缓解机体的这种氧化损伤,可以合理的摄入抗氧化剂。目前研究发现,乳酸菌除了具有降低胆固醇、抗癌、治疗结肠癌、增强免疫力等优点外[10-11]。乳酸菌在体内和体外具有抗氧化能力已被证实[12-15]。故筛选具有较高吸附铅离子能力和抗氧化能力的乳酸菌,可以为患有铅中毒的人们进行缓解症状,开发拥有双重功能的乳酸菌产品,具有重要的理论意义和实践意义。东北农业大学乳品科学教育部重点实验室乳品工业微生物菌种保藏中心(KLDS-DICC)拥有着丰富的乳酸菌资源,包括乳杆菌属、双歧杆菌属、链球菌属、乳球菌属、明串珠菌属、肠球菌属和酵母属等7个属,共计592株。经过近些年的研究,已筛选出具有多种功能的菌株,如降低胆固醇的植物乳杆菌KLDS1.0386[16],抑菌功能的短乳杆菌KLDS1.0355、嗜酸乳杆菌KLDS-AD1和KLDS1.0901[17]等。已有研究表明,乳酸杆菌具有吸附重金属的能力,如鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、双歧杆菌、干酪乳杆菌等[18-20]。因此,开展乳酸杆菌吸附重金属研就逐渐成为热点,本研究通过对本实验室的10株乳酸杆菌进行重金属吸附实验,并对其的抗氧化能力进行分析和评价,旨在筛选出具有双重能力的乳酸菌,为开发乳酸菌缓解铅中毒提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

10株乳杆菌 均分离自内蒙古传统发酵乳制品,经过16S rDNA测序鉴定分别为:嗜酸乳杆菌KLDS1.1003、植物乳杆菌KLDS1.0386、植物乳杆菌KLDS1.0344、德氏乳杆菌保加利亚亚种KLDS1.0207、鼠李糖乳杆菌KLDS1.0205、鼠李糖乳杆菌KLDS1.0911、鼠李糖乳杆菌KLDS1.0912、瑞士乳杆菌1.0903、副干酪乳杆菌KLDS1.0351,教育部重点实验室工业微生物菌种保藏中心提供;酵母粉 英文OXOID公司;蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酪蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、硫酸亚铁、双氧水、无水乙醇、三氯化铁、铁氰化钾 奥博星生物技术公司;DPPH、邻二氮菲、半胱氨酸、抗坏血酸、TBA、BHT 北京博奥拓达科技有限公司;硝酸铅 国药集团化学试剂有限公司;铅标准品(色谱纯) 德国默克集团有限公司。

CJ-2D超净工作台 天津泰斯特仪器有限公司;SPX-150B生化培养箱 上海佳胜实验设备;GL-21M高速冷冻离心机 上海市离心机械研究所;紫外可见分光光度计DU800 美国BECKMAN公司;电子天平 PL2002 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;900H原子吸收光谱仪 美国PERKINELMER公司。

1.2 实验方法

1.2.1 乳酸菌的培养与菌体制备 将乳酸菌以2%的接种量接于MRS液体培养基[21]中,置于37 ℃下培养24 h后,以同样的方式培养两代,收集18 h的菌体,将其置于8000×g,20 min,再用无菌的生理盐水洗涤3次,再次离心,直至上清澄清。

1.2.2 铅标准曲线的建立 分别取一定体积的1000 mg/L的铅标准品溶液,用20%的硝酸按比例稀释成质量浓度为2、4、6、8、10 mg/L的铅标准溶液。以铅离子质量浓度(X)为横坐标,吸光度值(Y)为纵坐标绘制铅标准曲线,得到铅标准曲线回归方程Y=0.01890X+0.01197,相关系数R2为0.9993。以铅标准曲线回归方程计算样品中铅含量。铅离子去除率的计算公式如下:

式中:RE为铅离子去除率,%;Ci为最初的金属离子质量浓度,mg/L;Ce为平衡时的溶液中的金属离子质量浓度,mg/L。

1.2.3 吸附铅离子能力的测定 将上述制备的菌体溶于含50 mg/L铅离子的水溶液中,使菌体浓度达到1 g/L,置于37 ℃下培养24 h后,于8000×g下离心20 min,收集上清后,用火焰原子吸收法测定铅离子含量。

1.2.4 乳酸菌细胞悬浮液和细胞破碎液的制备 取18 h的二代培养基,于8000×g,4 ℃下离心20 min,收集菌体,用无菌的生理盐水冲洗两次后,重新悬浮于生理盐水中,使菌液浓度为1.0×109CFU/mL,即得细胞悬浮液(IC)。

将上步收集细胞悬浮液,在冰浴条件下经超声波细胞粉碎机进行破碎,工作参数参考白明[22],显微镜下观察无完整菌体,然后于6000×g,离心10 min,收集上清,即为无细胞提取物(CFE),备用。

1.2.5 乳酸菌还原活性的测定 乳酸菌还原活性参照Lin等人[23]方法测定,并有适当改动。取0.5 mL样品加入0.5 mL 1%的铁氰化钾和0.5 mL的PBS(pH=7.2)混匀后,于50 ℃下放置20 min,快速将其冷却,加入0.5 mL的10%的TCA,再4000 g,5 min,取上清1 mL加1 mL的0.1%的三氯化铁混匀,静止10 min,测700 nm处吸光度。设置不同剂量的半胱氨酸组作为标准,将样品的吸光度值,换算为标准组的剂量(μmol/L)

1.2.6 乳酸菌清除DPPH自由基能力的测定 乳酸菌清除DPPH自由基能力根据Lin等人[24],翟齐啸等人[25]的方法进行测定,取1 mL的样,加入1 mL的0.2 mmol/L的DPPH溶液,37 ℃避光放置30 min,随后于7000 g,离心1 0 min,取上清测其517 nm处吸光值,以等体积蒸馏水和无水乙醇混合液空白调零。按照以下公式计算其清除力:

式中,A空为1 mL样品和1 mL无水乙醇反应的吸光值;A对为1 mL PBS和1 mL DPPH反应的吸光值,每组重复三次,取平均值。

1.2.7 乳酸菌清除羟基自由基能力的测定 乳酸菌清除羟基自由基能力参照Zhang等人和刘洋等人[26-27]的方法进行测定。将1 mL的2.5 mmol/L的1,10-菲罗啉,1 mL PBS(pH7.2),1 mL 样品,1 mL FeSO4混匀,,添加1 mL的双氧水到上边混合物中,置于37 ℃下1.5 h,测定536 nm的吸光度,并用蒸馏水做调零。按照下面公式计算其清除能力。

式中,A空为用1 mL蒸馏水取代1 mL样品的吸光值,A对为1 mL的蒸馏水取代1 mL双氧水的吸光值,每组重复三次,取平均值。

1.2.8 乳酸菌抗脂质氧化能力的测定 乳酸菌抗脂质氧化能力参照葛伟,Sabokbar等人和Wang等人[6,28-29]的方法进行测定,并作适当改动。在1 mL卵磷脂溶液中分别加入0.5 mL PBS(pH7.2)、0.2 mL的0.01%硫酸亚铁、0.2 mL的0.01%的抗坏血酸,0.5 mL样品,混匀后置于37 ℃下避光12 h,取2 mL混合液加入0.2 mL的4%的TCA,0.2 mL的0.8% TBA,0.2 mL的0.4%的BHT,置于90 ℃下25 min,冷却后,加入2 mL的氯仿,4000 g,室温下离心10 min,取上清测532 nm处吸光值。按照下面的公式计算其抗脂质氧化能力:

式中,A空为PBS取代样品的吸光值。

1.2.9 数据处理 本实验数据处理,运用SPSS 19.0和Origin 9.0软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌吸附铅离子能力的筛选

由图1可以看出,各个菌株之间差异性不同,KLDS1.0207和KLDS1.0903差异不显著,且与KLDS1.0351差异显著,去除率在22.47%～79.18%之间,其中KLDS1.0207菌的铅去除率最高,为79.18%,KLDS1.0351菌的铅去除率最低,为22.47%。乳酸菌是革兰氏阳性菌,细胞壁主要由肽聚糖、磷壁酸、脂磷壁酸、S-蛋白组成,表面有羧基、羟基、磷酸根、氨基等阴离子基团[30]。不同菌株的这些基团的的含量也是不同的[31]。通过一定方法减少表面的羧基基团,发现菌株吸附金属的量也减少[32]。当与溶液中金属阳离子接触时,这些基团可能参与,从而形成含铅的颗粒聚集在菌体表面[33]。Halttunen等人[18]研究发现不同乳酸菌的铅去除率范围在39.70%～69.60%,这与本文所得结果极为相近。

图1 乳酸菌在50 mg/L的铅离子溶液中的对铅的吸附能力Fig.1 Pb binding ability of LAB strains when incubated with an initial Pb concentration of 50 mg/L注:不同小写字母代表差异性不同(p<0.05),字母相同代表无差异;图2～图5同。

2.2 乳酸菌还原能力

铁氰化钾还原法的测定原理是:具有还原性的物质将铁氰化钾还原成亚铁氰化钾,亚铁氰化钾与三价铁离子反应生产不溶的普鲁士蓝,普鲁士蓝的最大吸收波长在700 nm[34]。

一般情况下,还原能力越强代表其抗氧化能力强。由图2可知,菌株之间差异性不同,菌体的还原能力范围在47.00～106.50 μmol/L的L-半胱氨酸之间,其中KLDS1.0344的还原能力最高(106.50 μmol/L),其次是KLDS1.0207(99.00 μmol/L),KLDS1.0912的还原能力最弱(47.00 μmol/L)。细胞提取物的还原能力范围在39.70～97.40 μmol/L的L-半胱氨酸之间,其中KLDS1.0207最大(97.40 μmol/L)、其次KLDS1.0344(87.30 μmol/L)、KLDS1.0911最小(39.70 μmol/L)。Zhai等[25]人测定CCFM8610的还原能力等同于99.41 μmol/L的L-半胱氨酸,这个结果与KLDS1.0207极为相近,略低于KLDS1.0344。

图2 乳酸菌的还原能力Fig.2 Reducing activity of LAB

2.3 乳酸菌清除DPPH的能力

DPPH自由基有单电子,其乙醇溶液呈现紫色,且在517 nm处有强吸收,当有自由基清除物质存在是,可以与其单电子配对,使其在517 nm处吸收减弱或消失,这种褪色程度与接受的电子数量成定量关系,由此可以定量分析生物试样和食品的抗氧化能力。

图3 乳酸菌对DPPH自由基的清除率Fig.3 Scavenging rates of LAB against DPPH free radical

由图3可知,不同菌株之间的DPPH自由基清除能力差异性不同,大部分菌株的DPPH清除率比对应的细胞提取物较高,仅有KLDS1.0344、KLDS1.0912的细胞提取物比菌株的DPPH清除率高。其中,菌株KLDS1.0207、KLDS1.1003、KLDS1.0903的DPPH清除能力较高,分别为50.40%、47.31%、47.46%,KLDS1.0912的DPPH清除能力最弱,为36.01%;KLDS1.0344、KLDS1.0912、KLDS1.0207的细胞提取物较高,分别为:42.10%、40.20%、33.60%,KLDS1.0911的细胞提取物的清除DPPH能力最弱为18.30%。Kachouri等人[35]对植物乳杆菌的清除DPPH自由基能力为57.07%,这个结果高于本文所供菌株的DPPH自由基清除能力。

2.4 乳酸菌清除羟自由基能力

将双氧水与邻二氮菲-Fe+2混合反应,产生羟自由基和邻二氮菲-Fe+3,橙黄色的邻二氮菲-Fe+2在536nm处的吸收峰消失,称为芬顿反应[36],且羟自由基具有强化氧化性,利用乳酸菌对产生的羟自由基进行清除,以此来评价抗乳酸菌的氧化能力。具体结果如图4所示。

图4 乳酸菌对羟自由基的清除率Fig.4 Scavenging rates of LAB against hydroxyl radical

由图4可知,菌株KLDS1.0386,KLDS1.0344、KLDS1.0911、KLDS1.0207的清除羟自由基能力较高,分别为33.15%、28.85%、27.60%、26.88%,KLDS1.0903的清除羟自由基能力最低,为12.23%;KLDS1.0386、KLDS1.0207、KLDS1.0903的细胞提取物对羟自由基的清除率较高,分别为:33.00%、26.33%、23.53%,KLDS1.003的细胞提取物对羟自由基的清除能力最弱,为12.20%。

2.5 乳酸菌抗脂质过氧化能力

采用硫代巴比妥酸(TBA)法测定抗脂质过氧化的能力。脂质过氧化是多不饱和脂肪酸和脂质的氧化变质,产生自由基,打破氧自由基反应和脂质过氧化反应在机体内的动态平衡,从而引起损伤生物膜等组织,使细胞结构和功能的改变[37]。

图5 乳酸菌对抗脂质过氧化的抑制率Fig.5 Inhibitory rate of LAB on lipid peroxidation

由图5可知,菌株KLDS1.0386、KLDS1.1003、KLDS1.0205、KLDS1.0351的抗脂质过氧化能力较高,分别为31.61%、29.89%、26.82%、18.30%,KLDS1.0912的抗脂质过氧化能力最弱,为8.72%;KLDS1.1003、KLDS1.0386、KLDS1.0205的细胞提取物的抗脂质过氧化能力较高,分别为:27.60%、25.20%、24.37%,KLDS1.0912的细胞提取物的抗脂质过氧化能力最弱,为11.83%。

3 结论

对10株乳酸菌吸附铅离子的能力和体外抗氧化能力评价进行了研究,结果表明,10株菌株均有吸附铅离子的能力和抗氧化能力,但不同菌株及对应的细胞提取物之间存在显著性差异(p<0.05)。其中,KLDS1.0207菌株的DPPH清除能力、清除羟自由基能力、还原能力三个指标较其他菌株能力强,同时,其具有最高的去除重金属的能力。结合以上结果,与其他菌株相比,KLDS1.0207菌株进行体内抗氧化能力具有明显优势,因此,在未来的研究中,我们可以利用该菌株进行体内缓解铅中毒造成的氧化损伤的评价,为深入研究提供有价值的参考。

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Invitroantioxidant activity of ten strains of lactobacillus with sequestering lead ions

YU Shang-fu,JIN Da,DING Xiu-yun,XU Min,HUO Gui-cheng*

(Key Laboratory of Dairy Science of Ministry of Education,College of Food Science, Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

In order to select strains of high adsorption of lead ions strains and has antioxidant capacity,the 10 strains of lactobacillus of lead ions adsorption experiment were conducted in this experiment,and the antioxidant capabilities of 10 strains of lactic acid bacteriainvitrowere evaluated through reducing radical activity assay,scavenging DPPH free radicals,scavenging hydroxyl free radical and inhibiting linoleic acid peroxidation. The ability to remove lead ions between different Lactobacillus different,not the same antioxidant capacity.The results showed that KLDS 1.0207 had the capacity of sequestering lead ions was 79.18%,reducing power up to 99.00 μmol/L cysteine equivalents. Scavenging action level of DPPH and hydroxyl free radicals were 50.40%,26.88% respectively.In liposome system,anti-lipid peroxidation resistance only reached 15.62%.This strain can be used to alleviate the oxidative damage in the body caused by lead poisoning.

oxidative damage;lactobacillus;oxidation resistance;biosorption

2016-05-24

于上富(1989-)，男，硕士研究生，研究方向：食品微生物与生物技术，E-mail：yushangf@163.com。

*通讯作者:霍贵成(1958-)，男，博士，教授，研究方向：食品微生物与生物技术，E-mail：gchuo58@126.com。

国家自然科学基金(31401512)；国家高技术研究发展计划(863计划)(2011AA100902)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)24-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.24.000