TG酶、Pepsin酶、Papain酶交联磁性微球对四环素吸附性研究

杨继涛,陈林霞,王刚刚,刘 杰,杨 敏

(1.甘肃农业大学理学院,甘肃兰州 730070;2.甘肃农业大学农业资源化学与应用研究所,甘肃兰州 730070;)

TG酶、Pepsin酶、Papain酶交联磁性微球对四环素吸附性研究

杨继涛1,2,陈林霞1,王刚刚1,刘 杰1,杨 敏1,2

(1.甘肃农业大学理学院,甘肃兰州 730070;2.甘肃农业大学农业资源化学与应用研究所,甘肃兰州 730070;)

利用戊二醛将谷氨酰胺转氨酶(TG)、胃蛋白酶(Pepsin)、木瓜蛋白酶(Papain)交联负载到氨基化磁性微球(AMM)上,制备出不同的固载酶的磁性吸附剂;使用扫描电子显微镜与红外光谱分析其结构特征,并研究酸度、初始浓度、吸附时间及温度对水中四环素吸附性的影响。结果表明:三种材料的静态吸附均为吸热过程,符合二级动力学方程及Freundlich吸附等温线,吸附机理为多层的化学吸附过程;在相同吸附温度下,吸附速率顺序为Pepsin-AMM>Papain-AMM>TG-AMM;当吸附温度为318 K时,吸附均为自发过程,其最大吸附量分别为99.72、64.97和67.52 mg/g。

磁性微球,四环素,吸附等温线,吸附动力学

四环素(Tetracycline,简称TC)是一种广谱的抗生素,具有杀菌作用,用于治疗和预防疾病,由于生产成本低廉,也用作饲料添加剂来提高养殖业禽畜的健康度[1-2]。四环素如同其它抗生素一样不能完全被人类与动物吸收,较大部分的摄入量是通过排泄物流入到环境中,由于其本身具有抑菌作用,微生物的降解过程不能将其有效地从环境中去除,如同重金属一样具有累积性,会造成水体、土壤的长期污染[3-4]。抗生素长期服用会使病菌产生很强的耐药性,所以各国均对肉食品中四环素族抗生素的残留情况加强了监控和检测,我国在无公害畜禽肉安全要求中规定的最高限量为100 μg/kg[5-7]。肉类食品工业化的进程,造成了四环素的排放问题,水与土壤中四环素不经处理又会回流到餐桌上,这种恶性循环产生的累积效应日益显著,已经成为人们关心的食品安全问题[8-9]。近些年来,以生物质材料作为吸附剂处理四环素污染受到了广泛关注,已报道的研究中如杏果壳[10]、澳洲坚果壳[11]、鸢尾[12]、玉米秸秆[13]等,这些原料经过改性煅烧后,变为活性炭型吸附剂;另一类如壳聚糖[14]、酵母菌[15]、花生壳[16]经过化学改性修饰,加强了材料的吸附性,以上吸附剂均对水中的四环素具有较好的吸附作用,具有可降解性,且制备工艺简单,实现了变废为宝。

四氧化三铁是具有生物相容性的磁性材料,其制备简单并且具有磁力响应的特质,为多学科热点研究方向[17]。利用共沉淀与水热法来制备四氧化三铁磁性微球,后将酶蛋白固载到磁性微球上,开发出具有磁特性的复合酶材料在食品工业已有广泛的研究[18-19]。谷氨酰胺转氨酶(Transglutaminase,简称TG)是一种交联性的酶,可通过分子交联及脱氨反应,使蛋白质结构发生变化,胃蛋白酶(Pepsin)与木瓜蛋白酶(Papain)是一种水解性酶,可以将蛋白质分解为小的肽段,以上三种酶是食品工业中使用广泛的酶制剂[20]。Pepsin酶和Papain酶固载于功能化磁性微球的研究报道较多,吴文兵等[21]利用Fe3O4磁性微球固载Papain酶,优化了固载条件,应用于啤酒蛋白质的水解;周冉等[22]利用Fe3O4磁性微球交联Papain酶,并外层包裹了二氧化硅,测定了其酶的活力变化;赵良忠等[23]利用反相悬浮交联法制备壳聚糖微球,利用化学共转化法制备出磁性壳聚糖微球,对Pepsin酶吸附性进行了比较。固载交联TG酶、Pepsin酶和Papain酶的磁性材料对水中四环素吸附研究未见报道。

本研究利用共沉淀法制备氨基化Fe3O4磁性微球(amination magnetic microsphere,简称AMM),使用戊二醛将TG酶、Pepsin酶和Papain酶分别交联在AMM上,制备出TG-AMM、Pepsin-AMM和Papain-AMM三种磁性蛋白复合材料作为吸附剂,考察吸附时间、吸附浓度、吸附温度及pH等因素对水中四环素的吸附能力的影响,计算吸附等温线、热力学及动力学相关参数,为吸附机理深入研究奠定基础,以期扩展酶交联磁性微球的应用方向并提供理论参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

氯化铁(FeCl3·6H2O)、氯化亚铁(FeCl2·4H2O)、戊二醛、浓盐酸、氢氧化钠、无水乙醇 上述试剂均为分析纯;3-氨基丙基三乙氧基硅烷 萨恩化学技术上海有限公司;四环素 纯度>98% 阿拉丁化学试剂;谷氨酰胺转氨酶(3000 U/g)、胃蛋白酶(100000 U/g)、木瓜蛋白酶(200000 U/g) 食品级,深圳恒生生物科技公司。

JA2003型精密电子天平 上海良平仪器仪表有限公司;酸度计PHS-3C 上海精密科学仪器有限公司;TU-1901双光束紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;SHZ-A型水浴恒温振荡器 江苏金坛市环宇科学仪器厂;傅立叶红外光谱仪 美国Digilab FTS3000型;日立 S-4800扫描电镜 日本Hitachi公司;SB-25-12DT超声波清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 酶交联磁性材料的制备

1.2.1.1 共沉淀法制备AMM 称取6.0 g氯化铁和2.85 g氯化亚铁加入500 mL蒸馏水溶解,在机械搅拌氮气保护下,向溶液中缓慢滴加0.1 mol/L NaOH溶液,调节pH至10,油浴60 ℃加热反应40 min,即有Fe3O4磁性颗粒生成,利用磁铁沉降弃去上清液,沉降物用蒸馏水洗涤两次后,再加入10.0 mL 3-氨基三乙氧基硅烷,50%乙醇溶液100 mL,油浴加热回流反应12 h,磁铁沉降出磁性颗粒,蒸馏水洗涤两次,无水乙醇洗涤一次后烘干待用,即得AMM[18]。

1.2.1.2 TG酶、Pepsin酶和Papain酶交联AMM 称取4 g TG酶溶解于100 mL蒸馏水中,后加入4 g AMM,超声分散30 min,频率为40 KHz,转移至三口烧瓶中,在机械搅拌氮气保护下,低速滴加2.5%戊二醛水溶液10 mL,滴加完毕后,油浴50 ℃加热反应6 h,利用磁铁沉降分离出磁性材料,再用蒸馏水洗涤三次后真空干燥待用,即得TG-AMM;Pepsin-AMM及Papain-AMM制备方法同上。

1.2.2 吸附剂的性状表征 利用扫描电镜对AMM、TG-AMM、Pepsin-AMM、Papain-AMM四种材料表面形态进行扫描观察;使用傅立叶红外光谱仪,对四种材料进行红外光谱比对分析,KBr压片,扫描波数范围400～4000 cm-1。

1.2.3 TG-AMM,Pepsin-AMM和Papain-AMM对水中四环素吸附性研究

1.2.3.1 四环素标准曲线绘制 配制梯度浓度(5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 mg/L)四环素溶液,使用紫外分光光度计(波长λ=360 nm),测其对应浓度的吸光度值,绘制出线性标准曲线,并将TG酶、Pepsin酶、Papain酶分别配置成50 mg/L水溶液,相同条件下测定其吸光度,同比于50 mg/L四环素水溶液[11,24]。

1.2.3.2 静态吸附实验条件 使用0.1 mol/LHCl和NaOH溶液来调节酸度,实验过程在避光或者弱光条件下进行;四环素水溶液每次准确移取50 mL放入到100 mL具塞的锥形瓶中,加入吸附剂后,置于水浴恒温摇床中进行吸附,摇床速率设定为100 r/min;每次吸附实验吸附剂均为TG-AMM,Pepsin-AMM和Papain-AMM平行操作,质量均为50 mg;吸附完毕后,用磁铁沉降吸附剂后取上清液测定残留的浓度,计算不同吸附剂的吸附量,吸附量的计算公式如下:

吸附量=(C0-Ce)×V/M

式中,C0为初始浓度,mg/L;Ce为吸附平衡后离子的浓度,mg/L;V为吸附溶液的体积,L;M为吸附剂质量,g。

1.2.3.3 酸度对吸附性影响 在静态吸附实验条件下,配制梯度pH为3、4、5、6、7、8、9、10,浓度为50 mg/L四环素水溶液,吸附时间为24 h,吸附温度设为303 K,实验平行测定三次,考察不同pH条件下吸附剂对水溶液中四环素的吸附量。

1.2.3.4 吸附时间对吸附性的影响 在静态吸附实验条件下,吸附浓度为50 mg/L,pH为7.0±0.1,吸附时间分别为10、20、30、40、50、60、120、180、240、300、360、720、1440 min,吸附温度设为303 K,实验平行测定三次,计算不同吸附时间的吸附量并拟合准一级吸附动力学方程,准二级吸附动力学方程,内扩散方程,表述如下:

准一级吸附动力学方程:ln(qe-qt)=lnqe-k1t

内扩散方程:qt=kit0.5+I

以上公式中,qt为t时刻的吸附量(mg/g);qe为平衡吸附量(mg/g);k1为准一级速率常数(min);k2为准二级速率常数(g/mg·min);ki为内扩散速率常数(mg/g·min);I为内扩散方程参数(mg/g)。

1.2.3.5 不同初始浓度和吸附温度对吸附性的影响 在静态吸附实验条件下,配制梯度浓度(10、20、30、40、50、60、70、80 mg/L)四环素溶液三组,pH为7.0±0.1,分别在吸附温度为288、303、318 K进行吸附,吸附时间为24 h,实验平行测定三次,计算不同初始浓度及不同吸附温度下的吸附量,计算并拟合Langmuir、Freundlich、Temkin吸附等温线,其方程表述如下:

Langmuir吸附等温线方程:1/qe=1/(qmbCe)+1/qm

Freundlich吸附等温线方程:lnqe=lnKF+(1/n)lnCe

Temkin吸附等温线方程:qe=Bln(kTCe)

以上公式中,Ce为平衡吸附浓度(mg/L);qe为平衡时吸附量(mg/g);qm为理论饱和吸附量(mg/g);b为Langmuir常数;KF和n为Freundlich吸附常数;kT和B为Temkin吸附常数。

2 结果与讨论

2.1 结构表征

2.1.1 扫描电镜 AMM,TG-AMM,Pepsin-AMM和Papain-AMM扫描电镜图如图1所示。

图1 AMM,TG-AMM,Pepsin-AMM和Papain-AMM扫描电镜图(10000×)Fig.1 SEM pictures of AMM,TG-AMM,Pepsin-AMM and Papain-AMM(10000×)

从AMM扫描电镜图可以看出,材料表面排布有序,由规则球体形状的颗粒相互聚集形成,其颗粒直径为20～30 nm;从TG-AMM、Pepsin-AMM和Papain-AMM扫描电镜图可以看出,磁性微球结构在交联前后发生了较大的变化,磁性微球之间发生了团聚,形成了形状不规则的颗粒,颗粒直径变大,说明材料外层包裹了酶蛋白材料;TG-AMM其材料表面比较平滑,而Pepsin-AMM和Papain-AMM材料表面比较粗糙,部分截面形成一定的层状特征,以上吸附剂与四环素水溶液接触时,TG-AMM接触面积少于Pepsin-AMM和Papain-AMM,表明TG-AMM吸附速度相比较慢。

2.1.2 红外光谱 Fe3O4磁性微球及吸附剂的红外光谱如图2所示。

图2 AMM,TG-AMM,Pepsin-AMM和Papain-AMM红外光谱图Fig.2 The infrared spectra of AMM,TG-AMM, Pepsin-AMM and Papain-AMM

从图2可以看出,AMM、TG-AMM、Pepsin-AMM和Papain-AMM红外谱图比对具有较好的相似性,均具有Fe3O4材料的特征吸收峰,其中在586 cm-1处的吸收峰,为Fe-O键的振动峰,在3438 cm-1处的吸收峰,为Fe3O4表面结构中的-OH基团的伸缩振动吸收峰,可证明在交联反应过程里,Fe3O4内磁核未发生其它的化学变化;其中TG-AMM,Pepsin-AMM和Papain-AMM在1633 cm-1左右均出现吸收峰,是酰胺键中C=O的特征吸收峰,说明几种酶蛋白均通过戊二醛交联固载到了磁核材料表面[25]。

2.2 吸附实验结果分析

2.2.1 四环素标准曲线 浓度为50 mg/L TG酶、Pepsin酶、Papain酶水溶液,在波长λ=360 nm测得吸光度分别为0.001、0、0,同浓度四环素水溶液吸光度为1.620,说明TG-AMM、Pepsin-AMM和Papain-AMM三种吸附材料,不会影响到四环素浓度测定的准确度;四环素线性回归方程为Y=0.0326X-0.00973,其中X为四环素的浓度,mg/L,Y为吸光度,其拟合系数为R2=0.9991。

2.2.2 pH对四环素吸附性的影响 pH对吸附性的影响结果如图3所示。

图3 pH对四环素吸附性的影响Fig.3 Effect of solution pH on adsorption of TC onto TG-AMM,Pepsin-AMM and Papain-AMM

2.2.3 吸附动力学 不同吸附时间对四环素吸附量的影响如图4所示。

图4 吸附时间对吸附量影响Fig.4 Effect of contract time for TC adsorption onto TG-AMM,Pepsin-AMM and Papain-AMM

从图4可以看出,三种吸附剂在0～120 min之间均为快速吸附,吸附量接近于线性递增;在120～360 min之间时,三种吸附剂吸附速率开始降低,但是Pepsin-AMM吸附速率降低较小,依旧接近于快速吸附,而TG-AMM与Papain-AMM吸附速率降低幅度较大;在360～1440 min时,三种吸附剂速率降为慢吸附过程,吸附缓慢接近于吸附的饱和峰值,其拟合相关的动力学方程见图5～图7。

图5 准一级动力学方程拟合Fig.5 Pseudo-first-order kinetics for TC adsorption onto TG-AMM, Pepsin-AMM and Papain-AMM

图6 准二级动力学方程拟合Fig.6 Pseudo-second-order kinetics for TC adsorption onto TG-AMM, Pepsin-AMM and Papain-AMM

图7 内扩散动力学方程拟合Fig.7 Intraparticle diffusion kinetics for TC adsorption onto TG-AMM,Pepsin-AMM and Papain-AMM

从图5～图7可以看出,从吸附动力学的线性关系相比较来看,准二级动力学方程拟合程度高,说明三种吸附剂均以化学吸附为主,相关动力学参数见表1[27]。

表1 吸附动力学参数

表2 吸附剂对四环素的吸附等温线拟合参数

TG-AMM、Pepsin-AMM和Papain-AMM的吸附均满足准二级动力学方程,其拟合系数R2分别达到0.9999、0.9901与0.999,拟合度非常高;实验中测定的平衡吸附量(qe,exp),TG-AMM为19.53 mg/g,Pepsin-AMM为30.57 mg/g,Papain-AMM为25.94 mg/g,而准二级动力学方程计算推导出的平衡吸附量(qe,cal),TG-AMM为15.55 mg/g,Pepsin-AMM为29.72 mg/g,Papain-AMM为24.64 mg/g,Pepsin-AMM和Papain-AMM平衡吸附量实验值与计算值之间偏差很小,更加验证了准二级动力学方程的合理性,而TG-AMM的计算值与实验值相差较大,说明了TG-AMM吸附为慢吸附过程,达到饱和吸附时间大于24 h。

2.2.4 吸附等温线 不同温度条件下吸附等温线实验结果如图7～图9所示。

图7 TG-AMM在不同温度下对四环素吸附等温线Fig.7 Adsorption isotherms for TC adsorption onto TG-AMM at different temperatures

图8 Pepsin-AMM在不同温度下对四环素吸附等温线Fig.8 Adsorption isotherms for TC adsorption onto Pepsin-AMM at different temperatures

图9 Papain-AMM在不同温度下对四环素吸附等温线Fig.9 Adsorption isotherms for TC adsorption onto Papain-AMM at different temperatures

从图7～图9可以看出,在同一吸附温度下,吸附量与平衡浓度随着初始浓度的增大而增加,最终接近到最大吸附量,体现了典型的吸附变化趋势,故Langmuir,Freundlichr及Temkin等温吸附线相关拟合性较高,其相关参数见表2。

从表2可以统计出,TG-AMM在吸附温度288、303和318 K,Langmuir、Freundlich及Temkin吸附等温线平均拟合系数(R2分别为0.9611、0.9604、0.9323,Pepsin-AMM平均拟合系数(R2分别为0.9577、0.9840、0.9381,Papain-AMM平均拟合系数(R2分别为0.9624、0.9847、0.9234;TG-AMM,Pepsin-AMM和Papain-AMM对于Freundlich及Langmuir吸附等温线拟合程度较高,相比之下Temkin吸附等温线拟合程度低不适用说明吸附过程。

表3 吸附剂对四环素吸附的热力学参数

Langmuir吸附等温线建立在单分子层吸附基础上,Freundlich吸附等温线建立在多分子层吸附基础上[27]。Pepsin-AMM和Papain-AMM吸附过程更符合Freundlich吸附等温线,偏向于多分子层吸附。在Langmuir吸附等温线中,Pepsin-AMM的最大理论吸附量为64.97 mg/g,吸附温度为318 K;Papain-AMM的最大理论吸附量为67.52 mg/g,吸附温度为318 K;TG-AMM的最大理论吸附量为201.7 mg/g,吸附温度为288 K,温度降低使得最大吸附量上升,主要原因应是TG-AMM吸附速率过慢造成的,拟合其最大理论吸附量出现了偏差,故其吸附过程不适用于Langmuir吸附等温线,更适用于Freundlich吸附等温线,偏向于多分子层吸附。

Freundlich吸附等温线系数1/n在0.1～0.5范围内,属于吸附容易发生,其值越大,表明吸附越困难,当1/n≥2时,属于吸附难以发生[28]。Pepsin-AMM和Papain-AMM的1/n为0.4～0.6之间,说明其吸附是相对容易进行的,而TG-AMM的1/n为0.75～1之间,说明吸附相对较难进行。

2.2.5 吸附热力学 将吸附等温线的实验结果,利用热力学公式lnKc=ΔS0/R-ΔH0/RT以及ΔG0=-RTlnKc,计算出吸附热力学参数,其中Kc为吸附热力学平衡常数;ΔG0为吸附标准吉布斯自由能变值,kJ/mol;R为气体摩尔常数8.314 J/(mol·K);T为吸附温度,K;ΔH0为吸附标准焓变,kJ/mol;ΔS0为吸附标准熵变值,kJ/(mol·K)[29]。TG-AMM、Pepsin-AMM和Papain-AMM对四环素吸附的热力学参数如表3所示。

分析表3可知,在静态吸附条件下,TG-AMM、Pepsin-AMM和Papain-AMM对四环素吸附ΔHo均大于0,说明吸附过程整体是吸热过程;ΔGo随着温度的升高,其值变小,说明升温有助于吸附,符合吸热型吸附过程的特点,当吸附温度不断升高时,三种吸附剂的ΔGo先后出现了负值,说明吸附过程具有了自发性,吸附速率均变快,当吸附温度变化时,ΔGo变化幅度较大,说明吸附温度对吸附影响是比较显著的。三种吸附剂的ΔSo大于0,说明四环素吸附到吸附剂上后,与酶蛋白材料之间结合点增多,故吸附剂的混乱度在增大,也说明了吸附剂外层的酶蛋白的酰胺键与水中四环素中极性基团由于电荷吸引而发生了化学吸附。

2.2.6 不同生物质吸附剂的最大吸附量比较 吸附温度为318 K时,相比于其它生物质吸附剂最大吸附量如图10所示[11,14-16]。

图10 不同吸附剂对四环素最大吸附量比较Fig.10 Comparison of maximum adsorption capacity of various adsorbents for TC

从图10可以看出,TG-AMM、Pepsin-AMM和Papain-AMM对四环素最大吸附量均高于壳聚糖及磁性酵母菌,而低于活性炭(澳洲坚果壳)与改性花生壳;澳洲坚果壳与花生壳为生物质材料,虽然吸附容量较高,但是上述吸附剂均无磁特性,不具有磁性材料的分离便捷性;磁性吸附菌为吸附菌固载在Fe3O4的复合型材料,虽然具有与三种酶材料相似的结构特点,但是其最大吸附容量较低,相比来看TG-AMM、Pepsin-AMM和Papain-AMM为使用便捷,吸附容量较高的吸附材料。

3 结论

利用共沉淀法制备出氨基化Fe3O4磁性微球,使用戊二醛交联剂,将TG酶、Pepsin酶、Papain酶分别交联在磁性微球上,使用扫描电镜和红外光谱比对分析了交联前后磁性材料的表面形貌变化及分子结构中基团特征,证明三种酶均交联固载在磁性材料上,其材料外层基团主要为酶蛋白的酰胺基,通过对水中四环素的静态吸附实验表明:TG-AMM、Pepsin-AMM和Papain-AMM对四环素吸附是一种吸热过程,吸附温度的提升有助于吸附,吸附过程均是以多层次的化学吸附为主,并满足准二级吸附动力学方程及Freundlich吸附等温线,当吸附温度为318 K时,三种吸附材料均为自主吸附,TG-AMM、Pepsin-AMM和Papain-AMM在pH为5～7吸附量较高,在pH=7时,其吸附速率的顺序为:Pepsin-AMM>Papain-AMM>TG-AMM。TG-AMM、Pepsin-AMM和Papain-AMM均对水中四环素具有较好的去除效果,综合比较而言,Pepsin-AMM具有较好的吸附性能,可以应用为水处理材料来降低水中四环素的含量及对食品中四环素残留物的检测,实现了酶材料的拓展应用。

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Study on adsorption of tetracycline by magnetic microsphere crosslinked with TG,Pepsin and Papain

YANG Ji-tao1,2CHEN Lin-xia1，WANG Gang-gang1，LIU Jie1，YANG Min1,2

(1.College of Science,Gansu Agricultural University,Lanzhou,Gansu,China 730070; 2.Institute of Agricultural Resources Chemistry and Application, Gansu Agricultural University Lanzhou,Gansu,China 730070)

Different enzyme-immobilized magnetic adsorbents were prepared by using glutaraldehyde to crosslink TG,Pepsin and Papain on amination magnetic microspheres. The adsorbents structure characteristics were analyzed by scanning electron microscope and infrared spectroscopy. The effect of initial concentration,adsorbent temperature,time and acidity on the adsorption of tetracycline in aqueous solution was investigated. Experimental results showed that the static adsorption accorded with the Pseudo-second-order kinetic and Freundlich adsorption isotherm,adsorption mechanism was not only multilayer chemical adsorption process but also endothermic process. Under the same adsorption temperature,the adsorption rate of order was Pepsin-AMM>Papain-AMM>TG-AMM. In the adsorption temperature was 318 K,adsorption process was spontaneous,the maximum adsorption capacities were 99.72,64.97 and 67.52 mg/g.

magnetic microsphere;tetracycline;adsorption isotherm;adsorption kinetics

2016-06-30

杨继涛(1981-)，男，理学硕士，讲师，研究方向：食品化学与生物质村料开发，E-mail:

国家大学生创新创业训练计划项目(20151073303)。

TS201.6

A

1002-0306(2016)24-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.24.000