沙利度胺联合达那唑对子宫内膜异位症裸鼠异位组织血管生成及血管内皮生长因子的影响▲

李 宁 苏 芳 宁海丹 彭 兴 尧良清 黄玉葵 范余娟

(1 广西南宁市妇幼保健院妇科，南宁市 530001，E-mail：lining0771@163.com；2 广西南宁市第三人民医院妇产科，南宁市 530003；3 广西壮族自治区民族医院病理科，南宁市 530001；4 广西医科大学药学院，南宁市 530021；5 复旦大学附属妇产科医院妇科，上海市 200011；6 广西医科大学第一附属医院妇科，南宁市 530021)

论著·基础研究

沙利度胺联合达那唑对子宫内膜异位症裸鼠异位组织血管生成及血管内皮生长因子的影响▲

李 宁1苏 芳2宁海丹3彭 兴4尧良清5黄玉葵1范余娟6

(1 广西南宁市妇幼保健院妇科，南宁市 530001，E-mail：lining0771@163.com；2 广西南宁市第三人民医院妇产科，南宁市 530003；3 广西壮族自治区民族医院病理科，南宁市 530001；4 广西医科大学药学院，南宁市 530021；5 复旦大学附属妇产科医院妇科，上海市 200011；6 广西医科大学第一附属医院妇科，南宁市 530021)

目的 探讨沙利度胺联合达那唑对子宫内膜异位症裸鼠异位组织血管生成及血管内皮生长因子(VEGF)的影响。方法 选择40只成功建立子宫内膜异位症模型的裸鼠， 随机分为模型对照、沙利度胺组、达那唑组及联合用药组，每组10只，分别给予生理盐水、沙利度胺30 mg/(kg·d)、达那唑1.0 mg/(kg·d)、沙利度胺30 mg/(kg·d)联合达那唑1.0 mg/(kg·d)腹腔注射，给药4周后处死，通过Ⅷ因子标记异位子宫内膜血管，检测异位内膜组织中微血管密度(MVD)，链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶法测定异位内膜VEGF蛋白的表达情况。结果 对照组、达那唑组、沙利度胺组和联合用药组的MVD依次降低(P<0.05)，分别为(21.3±1.5)个、(16±3.4)个、(12.2±1.1)个和(6.8±1.1)个。对照组、达那唑组、沙利度胺组和联合用药组VEGF蛋白的表达水平也依次降低(P<0.05)。结论 沙利度胺和达那唑可抑制裸鼠异位内膜的 MVD以及VEGF的表达，从而抑制异位内膜组织的血管生成，两者合用时作用更明显。

子宫内膜异位症；沙利度胺；达那唑；血管内皮生长因子；微血管密度；裸鼠

子宫内膜异位症是一种雌激素依赖性的良性的疾病，以子宫内膜组织在子宫外的存在和生长为特点，是最常见的一种良性妇科疾病[1]。这种疾病与不孕症以及严重的、丧失功能的疼痛症状有关，如慢性骨盆疼痛、痛经、性交困难[2-3]。 据估计，子宫内膜异位症可对10%的育龄女性产生影响，而由于其临床表现存在变异而往往不易诊断，真正的患病率有可能更高[4]。子宫内膜异位症常常对患者的工作、社会关系及婚姻生活产生严重的影响[5]。研究表明沙利度胺具有广泛免疫调节[6]、抗血管生成作用[7]以及抑制肿瘤生长的作用[8]。本实验通过分析沙利度胺、达那唑及两者联合用药对裸鼠子宫内膜异位组织中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表达以及组织中微血管密度(microvessel density，MVD)的影响， 探讨沙利度胺联合达那唑对子宫内膜异位症的治疗效果。

1 材料与方法

1.1 实验动物 56只清洁级性成熟未交配的雌性BALB/c裸鼠， 8～10周龄，体重(20±3)g(购自上海斯莱克实验动物有限公司，动物质量合格证号：SXCK沪2012-0002)。裸鼠喂养于温、湿度控制的环境中，研究期间裸鼠可自由进食和饮水。

1.2 实验试剂及仪器 沙利度胺片(江苏常州制药厂，规格：25 mg， 批号：H32026130)，达那唑胶囊(广州柏赛罗药业有限公司，规格：0.2 g， 批号：H20023742)，青霉素钠注射剂(哈药集团制药总厂，规格：80万单位，批号： H20023737)，硫酸庆大霉素注射液(国药集团容生制药有限公司，规格：2 ml：8 IU，批号： H41020609)，己烯雌酚注射液(广州白云山明兴制药有限公司，规格：1 ml：0.5 mg，批号： H44020233)。2%戊巴比妥钠由广西医科大学动物实验中心提供。 抗鼠Ⅷ因子抗体(批号：130506039A)、抗鼠VEGF 抗体(批号：130203059A)、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶(streptavidin-peroxidase，SP)试剂盒(批号：130420425H)、二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)显色剂(批号： 13003171)均购于上海抚生实业公司。BI2000 医学图像分析系统(成都泰盟有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 建模方法：术前1 d给予裸鼠己烯雌酚(0.1 mg/kg)皮下注射，使手术时裸鼠均处于发情期。在无菌环境下进行手术操作，术前用2%戊巴比妥钠腹腔注射对裸鼠进行麻醉，剂量为20 mg/kg。腹部备皮，消毒，在裸鼠脐与尿道口连线正中做一纵形切口，逐层分离皮肤、肌肉及腹膜。游离子宫体，切取一侧子宫角，长约1.0 cm，立即放入室温条件下的无菌生理盐水中，修剪子宫浆膜，将游离组织剪成3块(均包括子宫肌层)，大小均为5 m×5 m×5 m，1块送病理检验，明确为子宫内膜组织，另外2块将其内膜面紧贴腹壁，用000快薇乔线缝于左侧腹壁。术后腹腔留置青霉素钠生理盐水溶液预防感染，1号丝线分层缝合腹部切口。待其自然苏醒后每只裸鼠每天皮下注射庆大霉素0.1 ml，共3 d。实验裸鼠分笼单放，正常清洁饲养。分别于术后1周、2周，采用随机数字表法各选取2只裸鼠并处死，肉眼观察子宫内膜异位移植物生长情况，若形成暗红色或紫蓝色结节，可判断为移植组织已在裸鼠盆腔内生长。观察表明，子宫内膜异位移植物能在处死的裸鼠体内生长，遂于术后3周采用随机数字表法在剩余裸鼠中选取2只，开腹取其腹壁组织做成病理切片，行苏木精-伊红染色，显微镜下观察子宫内膜异位组织生长情况，证实有子宫内膜腺体及间质生长，判断建模成功。

1.3.2 分组及给药方法：采用抽签法随机选取40只建模成功的裸鼠并分为模型对照组、 沙利度胺组、达那唑组及联合用药组4组，每组10只。沙利度胺和达那唑使用时溶解于生理盐水中。达那唑组给予腹腔注射达那唑1.0 mg/(kg·d)，沙利度胺组给予腹腔注射沙利度胺 30 mg/(kg·d)， 联合用药组给予腹腔注射沙利度胺 30 mg/(kg/·d)和达那唑1.0 mg/(kg/·d)，模型对照组每日腹腔注射生理盐水2 ml，均1次/d，连续4周。裸鼠给药剂量根据每天每0.02 kg裸鼠给药剂量为每天每60 kg成人给药剂量的12倍换算得出。于停药24 h后麻醉动物，剖腹分离周围粘连组织，游离取出异位内膜组织，4%甲醛溶液固定所有标本12 h。常规脱水，石蜡包埋，连续切片(4 μm)，制病理片。

1.3.3 MVD的测定：标本以4%多聚甲醛固定，取材，切片。标本加入缓冲液，经羊血清去电荷和H2O2去过氧化物酶，加入一抗，抗鼠Ⅷ因子抗体及辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素，DAB显色，苏木素复染，封片。在低倍镜视野下选取微血管密集度区，根据 Weidner[9]采用的方法计微血管数。1.3.4 VEGF表达的测定：采用SP法检测VEGF在异位内膜组织的表达，实验按照SP试剂盒说明书进行。免疫组化结果用BI-2000图像系统分析，切片置于10×40倍镜下，随机选取5个视野， 计算阳性单位(positive unit，PU)作为量化指标。 PU=│Gα-GA│/[(1-AAα)/Gmax]×100，其中Gα 为阳性产物的灰度，GA为测试区域A范围内的平均灰度值，AAα为阳性产物在A测试区域中的面积密度，Gmax为图像分析仪设定的最大灰度值。用PU反映免疫组化染色强度，PU值越大则表示阳性反应越强，PU值越小则阳性反应越弱。

1.4 统计学分析 应用SPSS 16.0软件进行统计学分析，计量资料以(x±s)表示，比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组MVD比较 裸鼠模型异位内膜组织Ⅷ因子染色阳性细胞呈棕黄色，阳性染色细胞主要为血管内皮细胞；镜下微血管有的可见管腔，有的仅为内皮细胞簇或单个内皮细胞，见图1。每高倍视野下，对照组、达那唑组、沙利度胺组和联合用药组的MVD分别为(21.3±1.5)个、(16.0±3.4)个、(12.2±1.1)个和(6.8±1.1) 个，4组MVD比较，差异有统计学意义(F=200.603，P<0.001)，其中对照组、达那唑组、沙利度胺组、联合用药组的MVD依次降低(P<0.05)。

A 对照组 B 达那唑组 C 沙利度胺组 D 联合用药组

图1 采用Ⅷ因子标记的各组裸鼠子宫异位内膜组织MVD(DAB染色，×400)

2.2 各组VEGF表达比较 VEGF主要定存在于周围间质细胞中，见图2。BI2000医学图像分析，对照组、达那唑组、沙利度胺组和联合用药组的PU分别为(35±3)、(28±2)、(21±1)和(9±2)。4组PU比较，差异有统计学意义(F=185.091，P<0.001)，其中对照组、达那唑组、沙利度胺组、联合用药组的PU依次降低(P<0.05)。

A 对照组 B 达那唑组 C 沙利度胺组 D 联合用药组

图2 各组裸鼠子宫异位内膜组织VEGF 的表达情况(DAB染色，×400)

3 讨 论

沙利度胺又名酞胺哌啶酮，1953年在瑞士Ciba药厂首次合成，1957起在欧洲广泛用于治疗妊娠呕吐，1961年发现其与新生儿致畸有关而被禁用，这就是著名的“反应停事件”。 20世纪90年代，因沙利度胺具有抑制肿瘤坏死因子及抗血管生成的作用，而再次被重视，分别于1998年及2006 年被美国食品及药物管理局批准用于治疗麻风病和多发性骨髓瘤，再次进入人们的视线[10]。

在本研究中，我们通过裸鼠自体子宫内膜移植的方法，成功建立裸鼠子宫内膜异位症模型。我们发现裸鼠子宫内膜能够在腹壁上生长，形成异位内膜，在内膜移植后2周，异位内膜在裸鼠腹壁存活，并形成暗红色结节及滤泡结构。在内膜移植后3周，病理检查证实裸鼠腹壁处移植物为异位内膜，提示移植成功。

目前子宫内膜异位症的药物治疗主要采用激素抑制治疗，然而效果不尽如人意，患者常受停药后临床症状反复的困扰。这一现象促使我们进一步研究其他的治疗途径。抗血管生成、抑制VEGF蛋白分泌是有别于激素抑制治疗的全新的治疗思路，具有广阔的应用前景。在本研究中，联合用药组的MVD及VEGF蛋白的表达均显著低于沙利度胺组、达那唑组和对照组(P<0.05)，提示两者联合用药能更快地促进子宫内膜异位症裸鼠间质细胞的萎缩坏死，增强子宫内膜异位症血管生成的抑制，这一结果与我们的预期一致。这不仅与沙利度胺的抗血管生成作用有关，也可能与沙利度胺抑制子宫内膜异位症间质细胞分泌VEGF蛋白有关。Scarpellini等[11]报告沙利度胺治疗子宫内膜异位症的疗效能维持较长时间。沙利度胺抗血管生成的作用取决于其对VEGF及碱性成纤维细胞生长因子的影响。有研究证实，在多发性骨髓瘤细胞与骨髓基质细胞共同培养的环境下，沙利度胺可以抑制多发性骨髓瘤细胞VEGF的分泌[12]。此外，沙利度胺不但可以降低骨髓瘤细胞产生VEGF的水平，而且通过抑制VEGF，还可抑制细胞迁移、毛细血管生成及血管形成的能力[13]。达那唑的作用机制主要体现在抑制促性腺激素及卵巢分泌的甾体激素，从而促进子宫内膜异位症间质细胞的萎缩。

总之，为减轻子宫内膜异位症患者的临床症状、降低复发率，在临床中可以应用沙利度胺联合达那唑的治疗方法，但其治疗方案及治疗剂量尚待进一步在临床应用中探索。同时，由于沙利度胺具有可预测的致畸性，故在使用前需告知患者必须避孕。

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Effect of thalidomide combined with danazol on angiogenesis and vascular endothelial growth factor of ectopic tissues in nude mice with endometriosis

LINing1,SUFang2,NINGHai-dan3,PENGXing4,YAOLiang-qing5,HUANGYu-kui1,FANYu-Juan6

(1DepartmentofGynaecology,theMaternalandChildHealthHospitalofNanning,Nanning530001,China;2DepartmentofGynaecology,theThirdPeople′sHospitalofNanning,Nanning530003,China;3DepartmentofPathology,MinzuHospitalofGuangxiZhuangAutonomousRegion,Nanning530001,China;4SchoolofPharmacy,GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China;5DepartmentofGynaecology,theObstetricsandGynecologyHospitalAffiliatedtoFudanUniversity,Shanghai200011,China;6DepartmentofGynaecology,theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To investigate the effect of thalidomide combined with danazol on angiogenesis and vascular endothelial growth factor(VEGF) of ectopic tissues in nude mice with endometriosis.Methods Forty nude rats with successful modeling of endometriosis were randomly divided into control group,thalidomide group,danazol group and combined administration group,with 10 mice in each group.The control group,thalidomide group,danazol group and combined administration group were administered normal saline,halidomide[30 mg/(kg·d)],danazol[1.0 mg/(kg·d)] and halidomide[30 mg/(kg·d)] combined with danazol[1.0 mg/(kg·d)]by intraperitoneal injection respectively.All rats were killed after four weeks of administration.The ectopic endometrial vessels were marked by Ⅷ factor,and then microvessel density(MVD) of ectopic endometrium tissues was detected.The expression of ectopic endometrial VEGF was determined by streptavidin-peroxidase assay.Results MVDs decreased in the order of control group(21.3±1.5),danazol group(16±3.4),thalidomide group(12.2±1.1) and combined administration group(6.8±1.1)(P<0.05).The expression levels of VEGF protein decreased in the order of control group,danazol group,thalidomide group and combined administration group(P<0.05).Conclusion Thalidomide and danazol can inhibit the MVD and the VEGF expression of ectopic endometrium in the nude mice,thus can inhibit the angiogenesis in ectopic endometrium.Thalidomide combined with danazol can obtain more obvious inhibitory effect. 【Key words】 Endometriosis,Thalidomide,Danazol,Vascular endothelial growth factor,Microvessel density,Nude mice

广西科学研究与技术开发计划(桂科攻12300016)；广西南宁市科学研究与技术开发计划(20133174)

李宁(1978～)，女，硕士，副主任医师，研究方向：子宫内膜异位症的基础及临床。

宁海丹(1978～)，女，本科，主治医师，研究方向：妇科病理，E-mail：lovelygardenbaby@163.com。

R 711.71

A

0253-4304(2016)09-1207-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.09.05

2016-04-19

2016-06-29)