重症手足口病180例病原学检测及肠道病毒71型基因特征分析▲

邱宝强 颜云盈 李 梅 夏天航

(广西南宁市妇幼保健院儿科，南宁市 530011，E-mail：bh138@163.com)

论著·临床研究

重症手足口病180例病原学检测及肠道病毒71型基因特征分析▲

邱宝强 颜云盈 李 梅 夏天航

(广西南宁市妇幼保健院儿科，南宁市 530011，E-mail：bh138@163.com)

目的 探讨重症手足口病病原学特征，分析肠道病毒71型(EV71)基因型的特征。方法 重症手足口病患儿180例，采集发病一周内的咽拭子或肛拭子标本，应用实时反转录-聚合酶链反应方法检测标本中的肠道病毒。分别选取2014年及2015年各5例EV71检测阳性标本扩增基因的VP1区，测序并比对，构建进化树分析。结果 180份标本中肠道病毒核酸阳性153份，阳性率85.00%。153份阳性结果中EV71核酸阳性占50.3%(77/153)，柯萨奇病毒A组16型(CVA16)核酸阳性占19.6%(30/153)，其他肠道病毒核酸阳性占30.1%(46/153)。2014年及2015年以EV71为主，CVA16较少，两年间病毒型别构成比较，差异无统计学意义(P>0.05)。多元线性回归分析示，拟合回归方程：Y=2.095X1+0.462X2-0.214，式中Y为重症病例数，X1为EV71病例数，X2为其他肠道病毒病例数。EV71数可反映99.7%重症病例变化。不同年龄间病毒型别构成比较，差异无统计学意义(P>0.05)。发病高峰集中在每年4～8月；发病以4岁以下儿童为主，占82.7%，尤其是1～3岁年龄段(57.8%)。EV71 VP1区与C4a基因型代表株核苷酸同源性为91.6%～92.5%，氨基酸同源性为97.5%～98.8%，亲缘进化分析显示EV71与C4a基因型代表株处于同一分支。结论 EV71是本地区重症手足口病患儿主要病原，且属于C4a基因亚型。

手足口病；血清型；肠道病毒7l型 ；VP1基因

手足口病是小儿内科常见传染性疾病之一，临床表现为出疹、发热，主要病原体为肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A组16型(Coxasckie virus group A，type 16，CVA16)[1]。大部分患儿病程短，可自行愈合，预后良好。部分患儿可并发无菌性脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹、心肌炎等，甚至危及生命。其中大部分重症死亡患儿由EV71感染引起[2]。笔者对180例重症手足口病患儿进行肠道病毒分离鉴定及病毒基因分析，旨在了解该病病原体分布情况及基因特征。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2014年1月至2015年12月在我院诊断为重症手足口病患儿180例的标本。重症手足口病诊断符合《手足口病预防控制指南(2009年版)》[3]。男112例，女68例；年龄3个月至7岁。本研究经医院学术委员会同意批准实施。

1.2 方法 患儿确诊后3 d内无菌采集咽拭子或肛拭子置入病毒运送液中，送至实验室进行检测。分别选取2014年及2015年各5例EV71检测阳性标本扩增基因的VP1区，测序并比对，构建进化树分析。

1.2.1 病毒核酸提取：按照《手足口病预防控制指南(2009版)》[3]中的方法进行标本的采集和处理。采用Omega Viral RNA kit(美国Omega公司)提取病毒RNA。取200 μl拭子洗脱液进行RNA的提取，提取的RNA的终体积为50 μl。

1.2.2 EV71 VP1区基因扩增：使用PrimeScript RT reagent Kit[宝生物工程(大连)有限公司]对病毒RNA进行反转录，得到的cDNA作为VP1区基因扩增的模板。EV71 VP1区扩增引物序列如下：

VP1F：AGGGTGGCAGATGTAATTGA

VP1R：CCACTCTAAAGTTGCCCACGTA

扩增片段长度为1 042 bp。扩增反应条件为：95℃ 5 min；95℃ 45 s，50℃ 30 s，72℃ 1 min，共40个循环；72℃延伸10 min。扩增产物用2%琼脂糖凝胶进行电泳分析。

1.2.3 测序与分析：对扩增阳性产物进行DNA测序。使用DNAstar和MEGA 5.0进行DNA同源性分析和遗传进化分析。构建系统发生树所使用的EV71病毒各基因型代表株的序列来自于GenBank。

1.3 统计学分析 采用Excel 2003建立数据库，SPSS 13.0软件进行数据分析。计数资料的比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义；组间多重比较经Brunden法校正，以P<0.017为差异有统计学意义。单因变量和多因变量线性关系分析用多元线性回归分析。单向有序计数资料比较采用多组独立样本秩和检验(Kruskal-Wallis检验)，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 病原学检测情况 180份标本中肠道病毒核酸阳性153份，阳性率85.00%。153份阳性结果中EV71核酸阳性占50.3%(77/153)，CVA16核酸阳性占19.6%(30/153)，其他肠道病毒核酸阳性占30.1%(46/153)，见表1。2014年及2015年以EV71为主伴随其他肠道病毒，CVA16较少，两年间病毒型别构成差异无统计学意义(χ2=0.529，P=0.467)。

表1 手足口病重症病例病原学检测结果(n，%)

2.2 多元线性回归分析 2014～2015年病原学检测结果与重症发生例数行多元线性回归分析，CVA16病例数与重症发生例数无线性关系(P>0.05)未纳入回归模型，EV71病例数和其他肠道病毒例数纳入回归模型，拟合模型检验P<0.01，R2=0.999，EV71数可反映99.7%重症病例数变化。拟合回归方程：Y=2.095X1+0.462X2-0.214，式中Y为重症病例数，X1为EV71病例数，X2为其他肠道病毒病例数。见图1。

图1 回归标准化残差p-p图

2.3 病原学构成时间变化 2014～2015年1、2月及12月份几乎无发病，发病时间主要集中在4～8月份，共有127例(83.00%)。见图2。

图2 2014～2015年重症手足口病病原构成时间变化

2.4 不同年龄、性别病原学检测结果比较 在180例中男女性别比为1.65 ∶1。发病年龄主要集中于4岁以下儿童(87.2%)，尤其是1～3岁年龄段(57.8%)，5岁以上年龄组发病数急剧下降，其中以1～2岁年龄组的重症病例儿童最多。不同年龄间病毒型别构成比较，差异无统计学意义(H=9.727，P=0.083)。见表2和图3。

表2 180例不同年龄组病原体检测结果(n)

图3 各年龄组重症病例帕累托图

2.5 病毒分离与鉴定 采集的20例标本，提取病毒RNA，反转录得到cDNA，通过对EV71 VP1区进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增，PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳(见图4)。

图4 EV71 VP1 PCR产物2%琼脂糖凝胶电泳

2.6 EV71病毒VP1区核苷酸和氨基酸序列分析 分别选取2014年及2015年各5例EV71毒株，将10株EV71毒株与GenBank上的EV71各基因型与亚型代表株的VP1区基因序列进行比较及分析，10株EV71毒株与A、B、C型的核苷酸同源性分别为79.3%～81.5%、80.2%～83.9%、86.1%～92.5%，氨基酸同源性分别为91.2%～93.4%、94.0%～98.0%、96.7%～98.8%。与C4a亚型的同源性最高，见表3。

表3 EV71病毒VP1区核苷酸和氨基酸序列分析结果

2.7 EV71 VP1区基因亲缘关系分析 EV71 VP1区的基因亲缘关系树显示，10株EV71分离株与C4亚型在同一分支，属于C4a亚型，见图5。

图5 EV71分离株与各亚型代表株在VP1区的基因进化树

3 讨 论

引起重症手足口病的病原型均属小RNA病毒科肠道病毒属，目前共发现20余个血清型，主要包括埃可病毒、EV71型、CVA16组4、5、7、9、10、16型以及CVB组2、5、13型，在我国以CVA16和EV71型最为常见[4]。重症手足口病的病原学检测方法主要包括双份血清标本的中和抗体滴度测定、病毒分离培养、反转录-聚合酶链反应(reverse transcription-PCR，RT-PCR)。病毒分离培养为病毒性疾病诊断的“金标准”，是应用组织培养技术从传染源或感染部位分离出病毒并鉴定血清型，但因其过程繁琐、时间长，容易耽误手足口病的早期诊断，无法满足流行地区大样本的检测。RT-PCR技术利用肠道病毒特异性引物检测血清标本，以发现肠道病毒RNA同源的基因序列为判断依据，具有微量、快速、灵敏度高等优点[5]。该检测方法克服了血清学方法和病毒分离培养耗时、繁杂的缺点，能够在疾病流行期间同时检测大量标本，目前已成为快速诊断肠道病毒感染的重要手段。本文结果表明，2014～2015年重症手足口病病原学主要是以EV71为主伴随其他肠道病毒，CVA16较少，与其他学者[6-7]报告基本一致。

EV71是一种高度嗜中枢神经性肠道病毒，可累及中枢系统的任何区域，因此除了可引发与CVA16相似的重症手足口病、疱疹性咽峡炎等症状外，还导致中枢系统疾病，如脑炎、脑膜炎以及弛缓性瘫痪。1996年以前，EV71病毒主要传播于澳大利亚和美国，1996年之后流行于亚洲[8]。我国EV71感染引起的重症手足口病在20世纪90年代才逐渐占主导地位。杨洪等[9]对2008～2010 年深圳市手足口病就诊情况及病原学研究结果提示EV71是主要病原体，而 CVA16的发病率逐渐降低。郁会莲等[10]报告陕西省2008～2011年手足口病病毒以EV71型为主，占56.48%；重症病例为0.2%～20.0%，且多发生在4～7月，年龄多为≤3 岁，男孩居多，致病体为EV71型[10]。江苏省手足口病流行具有明显的季节性、人群性以及地区性，引起手足口病普通病例流行的病原体主要为EV71和CVA16，且不同年份间流行优势株有所差别，重症病例和死亡病例的流行优势毒株均为EV71[11]。本研究结果显示，引起本地区2014～2015年重症手足口病流行的主要病原是EV71；男性病例高于女性(男女之比为1.65 ∶1)；发病年龄主要集中于4岁以下儿童占87.2%，尤其是1～3岁年龄段占57.8%；时间分布主要集中在4～8月份，占总发病数的83.00%，与以往报告[3]相似。但不同年龄间病毒型别构成比较，差异无统计学意义，提示4岁以下幼童均为重症手足口病的高危感染人群。

大量实验表明，肠道病毒的VP1 编码区基因序列与病毒血清型相关，对于血清型的鉴定具有重要意义，而且该编码区的基因序列最大的变异速率，可进行亲缘性进化分析，用于分子流行病学研究[12-13]。本研究通过VP1编码区核苷酸序列测定和分析，确定分离毒株的血清型，并对分离到的EV71流行株进行基因特征分析。进一步将从GenBank检索到EV71各基因型和亚型的代表毒株VP1序列、全国各地近年分离的EV71病毒VP1序列，与本次分离出的EV71病毒VP1序列进行核苷酸和氨基酸序列同源性分析。结果表明，2014～2015年本地区10株EV71病毒分离株属于C4基因亚型同一个分支 (bootstrap 值为96)；与C4a基因亚型的代表株接近，核苷酸同源性为91.6%～92.5%，而氨基酸同源性为97.5%～98.8%，与国内报告[14]相似；与A、B基因型的差别比较大，核苷酸同源性为75.3%～81.5%，而氨基酸同源性为93.4%～99.2%；与C基因型的C1、C2、C3和C5比较，核苷酸同源性为85.3%～87.5%，而氨基酸同源性为95.1%～98.4%。

综上所述，本地区2014～2015年重症手足口病病原体与国内其他地区病原体类似，主要是EV71，但仍有部分未知的病毒，尚需要我们进一步研究。

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Etiological detection of 180 cases of severe hand-foot-mouth disease and characteristics analysis of enterovirus 71 gene

QIUBao-qiang,YANYun-ying,LIMei,XIATian-hang

(DepartmentofPediatrics,theMaternalandChildHealthHospitalofNanning,Nanning530011,China)

Objective To explore the etiological characteristics of severe hand-foot-mouth disease,and to analyze the characteristics of enterovirus 71(EV17) gene.Methods The specimens of throat swabs and anal swabs were collected from 180 children with severe hand-foot-mouth disease within one week of onset.The enterovirus of specimens was detected using real-time reverse transcription-polymerase chain reaction technology.VP1 region of gene was amplified in 5 specimens with positive EV71 from 2014 and 2015 separately.Then sequencing and comparison was conducted and the phylogenetic tree was constructed for analysis.Results Of 180 specimens,nucleic acid of enterovirus was positive in 153 specimens,accounting for 85.00%.And of 153 positive specimens,positive nucleic acid of EV71 accounted for 50.3%(77/153),positive nucleic acid of Coxsackie virus type A 16(CVA16) accounted for 19.6%(30/153),and positive nucleic acid of the other enterovirus accounted for 30.1%(46/153).EV71 was the main pathogenic virus and CAV16 was minor in 2014 and 2015,and there was no significant difference between the constituent ratios of virus type in 2014 and 2015(P>0.05).A multiple linear regression analysis revealed that the fitting regression equation:Y=2.095X1+0.462X2-0.214,Y:The number of severe cases, X1:The number of EV71 cases,X2:The number of other enterovirus cases.The number of EV71 cases could reflect the changes in 99.7% of severe cases.There was no significant difference in the constituent ratio of virus type among different age groups(P>0.05).The incidence peak was concentrated from April to August in each year.The children aged less than 4 years(82.7%) were common,especially the children aged 1 to 3 years(57.8%).The nucleotid homogeneity and amino acid homogeneity between VP1 regions of representative strains with EV71 and C4a genotypes was 91.6%-92.5% and 97.5%-98.8% respectively.The phylogenetic tree analysis showed that representative strains with EV71 and C4a genotypes were in the same branch.Conclusion EV71 is the main pathogen of children with severe hand-foot-mouth disease in the local area,and belongs to C4a subgenotype.

Hand-foot-mouth disease,Serotype,Enterovirus 71,VP1 gene

广西南宁市科学研究与技术开发计划(20133190)

邱宝强(1961～)，男，本科，副主任医师，研究方向：儿童感染性疾病。

颜云盈(1966～)，女，本科，副主任医师，研究方向：儿童感染性疾病和儿童重症医学，E-mail：nnyyy0818@sina.com。

R 725.1

A

0253-4304(2016)04-0482-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.04.10

2016-01-04

2016-03-21)