恒温实时荧光法快速检测简单异尖线虫方法的建立

张 森,邓 艳,黄燕琼,何淑华,戴 金,赵尚志,石 磊,柏建山,*

(1.华南理工大学食品科学与工程学院,广东广州 510640;2.广州机场出入境检验检疫局国家水产品检测重点实验室,广东广州 510470;3.暨南大学食品安全与营养研究院,广东广州 510632)

恒温实时荧光法快速检测简单异尖线虫方法的建立

张 森1,2,邓 艳2,黄燕琼2,何淑华2,戴 金2,赵尚志2,石 磊3,柏建山2,*

(1.华南理工大学食品科学与工程学院,广东广州 510640;2.广州机场出入境检验检疫局国家水产品检测重点实验室,广东广州 510470;3.暨南大学食品安全与营养研究院,广东广州 510632)

为了快速鉴定简单异尖线虫,本研究建立了一套检测简单异尖线虫DNA的恒温实时荧光环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法,根据LAMP方法原理,针对简单异尖线虫ITS2区域设计引物特异性识别靶标基因。进行了特异性、灵敏度、重复性和实际样品的测试,并与传统的PCR方法进行比较。结果表明,该方法能够特异性扩增简单异尖线虫DNA,对含有简单异尖线虫ITS2目的基因片段的质粒DNA检测限为1 fg/μL,灵敏度比传统的PCR方法高100倍,重复性良好,对实际样品进行检测,与传统的PCR测序方法结果相符。本研究建立的恒温实时荧光快速检测方法适用于特异性检测简单异尖线虫。

恒温实时荧光法,简单异尖线虫,快速检测

异尖线虫病是人感染异尖线虫的第三期幼虫引起的疾病,主要是由于食入生的或未熟的海鱼,如寿司、生鱼片等[1]。感染的异尖线虫可以钻入消化道,或移行到其它组织,从而引起人的急腹症症状:如剧烈腹痛、恶心、呕吐、腹泻等[1-4],还能导致人的过敏反应[5-7]。至今,全世界已有超过3万异尖线虫病例[3],已报道的引起人异尖线虫病的主要有6种[8-9],其中简单异尖线虫(Anisakis simplex)是引起人体异尖线虫病的最主要病原[3-4],它广泛存在于世界的各个地区[10-11],严重威胁了人类的健康。因此建立简单异尖线虫快速准确的检测方法至关重要。

表1 恒温实时荧光法引物序列

目前,异尖线虫幼虫的鉴定主要通过形态观察,并结合以PCR为基础的测序方法确定虫种[12],它提供了一种鉴定虫种的方法标准,但整个过程耗时耗力,还需要有笨重昂贵的仪器,很难再基层推广。环介导等温扩增(LAMP)技术是一种体外的基因扩增技术[13]。用4条特异性引物识别靶基因的6个区域,并加入两条环引物(LF、LB)加速反应,利用一种具有链置换功能的DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在恒温条件(60～65 ℃)反应30～60 min,即可完成反应。已有的简单异尖线虫的LAMP检测方法是利用琼脂糖凝胶电泳技术[14],观察有无梯状电泳条带做出判断,这种方法容易造成LAMP扩增产物气溶胶污染。本研究将LAMP技术与实时荧光技术相结合,根据简单异尖线虫ITS2区域设计特异性引物[15],利用实时荧光技术可以将LAMP反应可视化,进行实时监控,根据扩增曲线判断结果,并进行了灵敏度、特异性和重复性验证。与传统的LAMP技术相比,反应时间更短,反应的灵敏度和特异性更高,操作更为简便,成本更加低廉,适合在基层推广应用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

简单异尖线虫(Anisakissimplex)、短棘异尖线虫(A.brevispiculata)、抹香鲸异尖线虫(A.physeteris)、典型异尖线虫(A.typica)、Anisakisnascettii、宫脂线虫(HysterothylaciumSpp.)、对盲囊线虫(ContracaccumSpp.)、颚口线虫(Gnathostomaspp.) 由广州机场检验检疫局国家水产品检测重点实验室在2011年至2015年进境鱼体中分离鉴定并保存;Bst DNA polymerase large fragment 美国New England Biolabs公司;甜菜碱 Betaine;MgCl2美国Sigma公司;SYBR Green I 荧光染料 Life Technologies公司;引物 上海英潍捷基贸易有限公司;DNA提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒、18-T载体克隆试剂盒、DH5α感受态细胞、质粒提取试剂盒、Tap酶、Mg2+、dNTPs、PCR10×Buffer反应液 均购自宝生物工程(大连)有限公司。

LAMP恒温扩增检测仪Deaou-308C 广州迪澳生物科技有限公司;凝胶成像系统Gel Doc EQ 美国BIO-RAD公司;核酸浓度测定仪ND-2000 美国NanoDrop科技有限公司;微型离心机Mini-10K 广州迪奥生物科技有限公司;微量振荡器 MS2 德国IKA集团;高速离心机D-78532 德国Hettich科学仪器公司;梯度PCR仪T-gradient thermoblock 德国Biometra公司等。

1.2 实验方法

1.2.1 虫体基因组DNA提取 将虫体从保存液中取出,置于1.5 mL离心管中,用蒸馏水反复浸泡清洗3次,每隔2 h换水1次,使用Takara公司的Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0试剂盒,按照说明书步骤提取异尖线虫基因组DNA,用NanoDrop 2000微量紫外分光光度计检测基因组DNA的浓度,将基因组置于-20 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 引物设计与合成 从GenBank中获得简单异尖线虫ITS2(AB277823)序列,根据ITS2的保守区,利用在线设计软件Primer Explorer version4(http://primerexplorer.jp/e)进行LAMP引物的设计。设计3套引物,将设计好的引物序列在NCBI网站进行序列特异性比对,并利用Oligo 7.0对引物之间的二聚体、发夹结构、错配等情况进行分析,引物由上海英潍捷基贸易有限公司合成。根据引物筛选实验结果,选取最优引物,最终使用的引物为第一组引物(见表1)。

1.2.3 引物的筛选 本研究根据简单异尖线虫的ITS2 rDNA设计了3套引物,进行引物筛选实验,选取最优引物作为实验引物。

1.2.4 质粒构建 用LAMP引物的外引物F3、B3对简单异尖线虫基因组DNA进行PCR扩增,使用Takara公司的Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0试剂盒,按照说明书步骤进行DNA片段的回收,使用Takara公司的pMDTM 18-T Vector Cloning Kit 试剂盒,按照说明书步骤进行质粒构建,使用Takara公司的Plasmid Purification Kit Ver.4.0试剂盒,按照说明书步骤进行质粒的提取。用NanoDrop 2000微量紫外分光光度计检测质粒DNA的浓度,将质粒置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.5 恒温实时荧光法反应体系的建立 本研究采用25 μL反应体系,8 mmol/L dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、120 mmol/L MgSO4水溶液、F3 0.2 μmol/L、B3 0.2 μmol/L、FIP 1.6 μmol/L、BIP 1.6 μmol/L、LF 0.8 μmol/L、LB 0.8 μmol/L、DNA聚合酶8 U、10×SYBR Green I荧光染料 0.5 μL、待检样品2 μL,用超纯水补齐到25 μL,最后在体系表面加密封油防止污染,将配制好的反应管混匀后离心,以简单异尖线虫DNA为阳性对照,超纯水为阴性对照,于LAMP恒温扩增检测仪中63 ℃反应30 min。

结果判读方法:若有“S”型扩增曲线,则判断为阳性,若无“S”型扩增曲线,则判断为阴性。

1.2.6 特异性实验 用建立的恒温实时荧光法对其它寄生虫短棘异尖线虫(A.brevispiculata)、抹香鲸异尖线虫(A.physeteris)、典型异尖线虫(A.typica)、anisakisnascettii、宫脂线虫(HysterothylaciumSpp.)、对盲囊线虫(ContracaccumSpp.)、颚口线虫(Ggnathostomaspp.)的DNA进行扩增。

1.2.7 灵敏度实验 将含目的基因片段的质粒DNA以10倍的梯度稀释到1 ng/μL、100、10、1 pg/μL、100、10、1 fg/μL、100、10 ag/μL,取10 pg/μL～10 ag/μL浓度的模板进行恒温实时荧光法扩增。

1.2.8 与PCR方法比较 用外引物F3、B3作为PCR引物对10 pg/μL～1 fg/μL质粒模板进行PCR扩增,体系为25 μL:2.5 μL 10×PCR buffer,2 mmol/L Mg2+,0.8 mmol/L dNTPs,0.4 μmol/L F3引物,0.4 μmol/L B3引物,1.25 U Taq酶(Takara),2 μL DNA模板,用超纯水补齐至25 μL。反应程序为:95 ℃预变性5 min;95 ℃变性45 s、60 ℃退火延伸1 min,40个循环。反应产物在1%琼脂糖凝胶中进行电泳20 min。

1.2.9 实际样品的检测 对广州机场检验检疫局国家水产品检测重点实验室在2011年至2015年,从37批次鱼体中检出的异尖线虫进行检测,每一批次中挑取一条代表性虫体进行恒温实时荧光法检测,并与PCR检测方法进行比较。PCR检测方法依据中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SC/T7210-2011,使用上游引物390(5′-ATCCGTGTTTCAAG ACGGG-3′)和下游引物391(5′-AGCGGAGGAAAA GAAACTAA-3′)对虫体DNA进行扩增,反应体系参照1.2.8,反应程序为:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,35个循环;72 ℃延伸8 min。反应产物大小为800 bp左右,送测序公司测序,将测序结果在NCBI网站上进行序列比对。

2 结果与讨论

2.1 恒温实时荧光法反应条件的确定

用3套特异性引物对简单异尖线虫DNA进行恒温实时荧光法扩增,筛选出最优的特异性引物。结果显示,3套引物均能扩增,而第一套引物扩增曲线最标准,出峰时间最短(见图1),所以选取第一套引物作为本研究的特异性引物。

图1 恒温实时荧光法引物反应效率的检测Fig.1 Efficiency of real-time LAMP primers

2.2 特异性实验

特异性实验表明,对于短棘异尖线虫(A.brevispiculata)、抹香鲸异尖线虫(A.physeteris)、典型异尖线虫(A.typica)、anisakisnascettii、宫脂线虫(Hysterothylaciumspp.)、对盲囊线虫(Contracaccumspp.)、颚口线虫(Ggnathostomaspp.)的DNA模板,未产生“S”型扩增曲线,说明没有目的片段扩增,对于简单异尖线虫DNA模板,产生“S”型扩增曲线,说明目的片段能够扩增(见图2),表明建立的简单异尖线虫的恒温实时荧光检测方法具有严格的特异性。

图2 简单异尖线虫恒温实时荧光法特异性实验Fig.2 Assessment of specificity of the real-time LAMP assay for A. simplex

2.3 灵敏度实验

含目的基因片段的质粒浓度为29 ng/μL,将其稀释到1 ng/μL、100、10、1 pg/μL、100、10、1 fg/μL、100、10 ag/μL,选取10 pg/μL～10 ag/μL质粒模板进行恒温实时荧光法扩增,其检测限为1 fg/μL(见图3)。用PCR方法对10 pg/μL～1 fg/μL质粒模板进行扩增,其检测限为100 fg/μL(见图4),恒温实时荧光法的灵敏度比PCR方法高出两个数量级。表明建立的简单异尖线虫恒温实时荧光检测方法具有很高的灵敏度。

图3 简单异尖线虫恒温实时荧光法的灵敏度实验Fig.3 Assessment of sensitivity of the real-time LAMP for A. simplex注:1～5分别表示10 pg/μL、1 pg/μL、100、10、1 fg/μL浓度的质粒。

表2 实际样品中恒温实时荧光法和PCR方法检测简单异尖线虫的结果

图4 简单异尖线虫恒温实时荧光法与PCR方法的比较Fig.4 Comprision with conventional PCR注:M表示DNA Marker,1～5分别表示10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL、1 fg/μL浓度的质粒,6代表空白对照。

2.4 重复性实验

用恒温实时荧光法对最低检测限1 fg/μL的质粒模板进行15次重复实验,验证本研究的重复性。对1 fg/μL质粒模板的15次平行实验,均产生“S”型扩增曲线,说明全部扩增,且出峰时间相差不大,扩增曲线标准,重复性良好,阴性对照无扩增,假阳性率为0(见图5)。表明建立的简单异尖线虫的恒温实时荧光检测方法具有良好的重复性。

图5 简单异尖线虫恒温实时荧光法的重复性实验Fig.5 Assessment of repeatability of the real-time LAMP for A. simplex

2.5 实际样品的检测

用恒温实时荧光法对37批次实际样品进行检测,并与PCR检测方法进行比较。恒温实时荧光法检测结果与PCR检测结果完全一致,假阳性率为0(见表2)。说明本研究建立的LAMP检测方法适用于简单异尖线虫实际样本的检测。

2.5 讨论

自1960年van Thiel在荷兰发现并报道了异尖线虫病例后,国际上感染并报道的异尖线虫病例越来越多。所以异尖线虫日益受到各界的重视,我国已将异尖线虫列为二类禁止入境的寄生虫。我国在2013年报道了首例异尖线虫病病例[16]。

在所有的虫种中,简单异尖是最主要的致病种。为了能够更好的检测简单异尖线虫,有效控制其传播和感染,快速、灵敏和准确的检测方法是必不可少的。LAMP方法已经应用于检测食源性病原的多个领域,如:细菌、病毒、真菌、原虫[17-18],但在蠕虫检测上的应用还很少,影响了蠕虫病病原检测技术的发展。以往,LAMP检测方法的结果判定有凝胶电泳法、显色法、浊度法。凝胶电泳法需要开盖才能完成,可能产生气溶胶污染,而造成假阳性,荣研公司也推荐不开盖原则;显色法是最经济的方法,不需要在反应过程中收集信号,只需恒温水浴锅即可完成反应,但显色法需要反应结束后开盖加入显色液,也容易造成扩增产物的气溶胶污染;浊度法包括焦磷酸镁沉淀观察法和实时浊度法,不需要添加额外的试剂,不需要开盖,但焦磷酸镁沉淀观察法存在人为判断的主观性,实时浊度法也因浑浊颗粒不均一和反应液存在不透明颗粒等因素导致较低的灵敏度。为了克服上述方法的不足,恒温实时荧光法不断被发开并应用于实际的样品检测中,它是一种新型的可视化方法,将LAMP技术与实时荧光检测技术有机的结合,可以对扩增过程进行及时判读,在保证高敏感性的同时,使检测结果数据化、形象化,不同于终点判读方法,可以在反应过程中对出峰时间、扩增曲线以及扩增效率进行实时监控,使反应时间更短,在一定程度上避免了假阳性的存在。

3 结论

本研究根据简单异尖线虫的ITS2特异性基因,建立了简单异尖线虫的恒温实时荧光检测法,该方法具有灵敏度高、特异性好、方便和快速等优点,灵敏度可达1 fg/μL,反应时间短,30 min内便可完成反应,而传统的PCR方法至少需要2～3 h。该检测方法具有广泛的实用性和良好的应用前景,特别适合于在基层进行推广和应用。

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A real-time fluorescence loop-mediated isothermal amplification method for the detection ofAnisakissimplex

ZHANG Sen1,2,DENG Yan2,HUANG Yan-qiong2,HE Shu-hua2,DAI Jin2,ZHAO Shang-zhi2,SHI Lei3,BAI Jian-shan2,*

(1.School of Food Science and Technology,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China; 2.State key Testing Laboratory of Aquatic Products,Guangzhou Airport Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau,Guangzhou 510470,China; 3.Research Institute of Food Safety and Nutrition,Jinan University,Guangzhou 510632,China)

We established a real-time fluorescence loop-mediated isothermal amplification(LAMP)approach for the sensitive,rapid and reliable detection ofAnisakissimplex. The method was based on LAMP reaction. Three sets of the specificity and sensitivity of primers were designed from ITS2 rDNA. The specificity and sensitivity were tested. Specific amplification products were obtained withA.simplex,while no amplification products were detected with DNA of related parasites,demonstrating the specificity of the assay. The capable detection of plasmid DNA in the method was 1 fg/μL. The real-time fluorescence LAMP assay was proved to be 100 times more sensitive than a conventional polymerase chain reaction for detection ofA.simplex. 37samples testing by the real-time fluorescence LAMP method and PCR method showed that,the result of the LAMP method was the same with PCR method. The established real-time fluorescence LAMP method was suitable for specifically detectingA.simplex.

real-time fluorescence loop-mediated isothermal amplification;Anisakissimplex;rapid detection

2016-03-11

张森(1988-),男,在读研究生,主要从事水生动物病原检测,E-mail:525922989@qq.com。

*通讯作者:柏建山(1976-),男,高级兽医师,主要从事水生动物病原检测,食品微生物病原检测,E-mail:bjslinyi@ sina.com.cn。

国家质量监督检验检疫总局科技计划项目(2015IK055);广东省科技项目(2014A040401063)。

TS207.4

A

1002-0306(2016)24-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.24.000