哈萨克羊BMP15基因多态性研究

陈春华，刘宜勇，丁克奇，刘建明，杨光维*，吐来力江，团 勇，道尔基

（1.新疆伊犁州畜牧科学研究所，新疆 伊宁 835000；2.新疆尼勒克县畜牧兽医工作站，新疆 尼勒克 835700）

哈萨克羊BMP15基因多态性研究

陈春华1，刘宜勇1，丁克奇2，刘建明1，杨光维1*，吐来力江1，团 勇1，道尔基1

（1.新疆伊犁州畜牧科学研究所，新疆 伊宁 835000；2.新疆尼勒克县畜牧兽医工作站，新疆 尼勒克 835700）

为了探索绵羊多胎性的分子机理以及为绵羊繁殖力的标记辅助选择和育种提供理论依据，采用PCR-RFLP及PCR-DS方法，对哈萨克羊群体BMP15基因FecXG和FecXB及第2外显子进行多态性检测。结果表明：BMP15基因FecXG和FecXB位点均未出现多态性，在第2外显子存在2种基因型，AA型和AB型；测序结果表明：AB型个体在该基因第775位点发生G→C的突变，出现G/C的杂合。优势基因型为AA型，优势等位基因为A基因，多态信息含量小于0.25，属于低度多态；χ2适合性检验表明：处于Hardy-weinberg平衡状态；显著性检验分析表明：该突变位点在不同产羔数母羊群体中的分布有一定的差异。该突变位点可以作为控制绵羊多胎产羔的潜在分子标记位点。

哈萨克羊；BMP15基因；PCR-RFLP；PCR-DS；多态性

绵羊的繁殖性能是一个重要的经济性状，在群体内表现连续变异，是由一系列主基因或数量性状基因座（Quantitative Trait Locus，QTL）决定的[1]，且遗传力只有0.1左右，很难用常规的技术来提高。目前，国内外提高绵羊繁殖性能最常见的方法是利用基因工程等技术进行分子育种，从根本上改变其繁殖性能。而找到与繁殖性能相关的分子标记位点是实现这个目标的基础。

绵羊的骨骼形态发生蛋白15基因（Bone Morphogenetic Protein 15 BMP15）是TGFβ超家族最大亚家族BMP家族中的一员，也称为生长分化因子9B（growth differentiation factor 9B GDF9B），位于绵羊X染色体上，是一种在卵巢表达的卵母细胞衍生因子。BMP15可以通过和卵泡抑素的结合调节自身的生物活性，对早期卵泡的生长和分化起到重要调节作用。

目前在绵羊中发现了BMP15基因6个与繁殖力相关的突变。即FecXI、FecXB、FecXL、FecXH、FecXG和FecXR。其中任何一个突变杂合的所有母羊都表现有较高的排卵数，突变纯合个体由于卵巢没有初级卵泡而导致完全不育。Galloway等[2]（2000）发现了Inverdale绵羊BMP15基因的FecXI突变和Hanna绵羊BMP15基因的FecXH突变；Hanrahan等[3]（2004）在Belclare绵羊和Cambridge绵羊BMP15基因编码区发现了FecXG突变，在Belclare绵羊BMP15基因编码区发现了FecXB突变；Bodin等[4]（2007）发现了Lacaune绵羊BMP15基因的FecXL突变；Monteagudo等[5]（2008）和Martinez-Royo等[6]（2008）几乎同时发现了BMP15基因与繁殖力相关的第6个突变，即西班牙Rasa Aragonesa绵羊BMP15基因第二外显子第525～541位缺失17个核苷酸，根据BMP15基因突变的命名规则，该突变命名为FecXR。国内学者对小尾寒羊和湖羊展开了BMP15基因的研究，发现高繁殖力的小尾寒羊发生了BMP15基因的FecXG突变，推测小尾寒羊的多胎性可能与该突变有关系。本实验以哈萨克羊为实验材料，采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性（Polymerase Chain Reaction-Restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）及直接测序法（PCR-DS）方法对BMP15基因进行多态性检测与分析，查找哈萨克羊在该基因酶切位点中的多态性，并对具有多态性的DNA片段进行测序分析，以期在该基因中找到与哈萨克羊产羔性状相关的遗传标记位点，为开展标记辅助选择提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验羊是在尼勒克县、特克斯县、昭苏县提供的2 000多只羊群体中选择抽取719只，其中411只产双羔羊，308只产单羔羊。颈静脉采血，ACD抗凝，供提取绵羊基因组DNA。

1.2 试验方法

1.2.1 基因组DNA的提取 参照《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》[7]以及常规酚-氯仿抽提法提取血液基因组DNA。

1.2.2 引物设计和PCR扩增 参照GeneBank中绵羊BMP15基因（登录号：NM_001114767）利用Olig 6.0和Primer 5.0设计引物如下表。

表1 检测哈萨克羊多胎候选基因的引物

PCR扩增体系为25 μL，包括：10×PCR缓冲液2.5 μL；10 pmol/L引物0.5 μL；dNTPs2.0 μL；2.5 U/μL TaqDNA聚合酶0.25 μL；100 ng/μL的DNA模板1.0 μL，其余用水补齐至25 μL。

1.2.3 PCR扩增条件为 94℃预变性3 min；94℃变性30 s；62～55℃退火30 s；72℃延伸30 s；35个循环，72℃延伸10 min；4℃保存，产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.4 PFLP分析 5 μLPCR 扩增产物；1.5 μL 10× Buffer；0.5 μL限制性内切酶；3 μL水。

反应条件：37℃水浴；4 h左右；3%琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，并在凝胶成像仪上成像观察结果，并保存图像。

1.2.5 产物回收与测序 根据RFLP分析结果，挑选出不同带型的PCR产物各2个，用2%的琼脂糖凝胶进行检测，利用PCR产物回收试剂盒回收，并将回收后的产物送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。

1.3 统计与分析

利用Chromas2、MEGA 5.05软件进行测序结果分析；使用Popgene Version 32生物软件计算等位基因频率、基因型频率、群体杂合度（He）、有效等位基因数（Ne），并检验是否处于Hardy-weinberg平衡；采用PIC软件计算多态信息含量（PIC）值；利用SAS 8.0软件进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增结果

2.1.1 BMP15基因FecXG位点PCR扩增结果 用FecXG位点的引物对哈萨克羊基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物片段与目的片段大小一致（141 bp）（图1），结果表明：特异性良好，可直接用于RFLP分析。

图1 FecXG基因的PCR产物

2.1.2 BMP15基因FecXB位点PCR扩增结果 用FecXB引物对哈萨克羊基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物片段与目的片段大小一致（153 bp）（图2），结果表明：特异性良好，可直接用于RFLP分析。

图2 FecXB基因的PCR产物

2.2 PCR-RFLP结果

2.2.1 BMP15基因FecXG位点PCR-RFLP结果 用Hinf I内切酶对BMP15基因FecXG位点所扩的PCR产物进行酶切，用3%琼脂糖电泳对酶消化产物进行检测，得到111 bp条带，显示PCR产物没有被酶切开（图3）。

图3 FecXG基因的PCR产物酶切结果

2.2.2 BMP15基因FecXB位点PCR-RFLP结果 用Dde I内切酶对BMP15基因FecXB位点所扩的PCR产物进行酶切，用3%琼脂糖电泳对酶消化产物进行检测，结果只有122 bp的酶切条带，说明该位点在哈萨克羊中不存在多态性（图4）。

图4 FecXB基因的PCR产物酶切结果

2.3 测序结果

对第二外显子的PCR产物进行直接测序。测序结果发现：野生型AA型和突变型AB型相比，在AB型个体中，BMP15基因第775位点有一个G和A的杂合（图5）。

图5 绵羊BMP15基因AA型和AB型测序结果比较

2.4 BMP15基因第2外显子的群体遗传学分析

通过对不同产羔数的719只哈萨克羊样本直接测序检测结果进行分析发现（表1），优势基因型均为AA型，优势等位基因为A基因。群体杂合度（He）、有效等位基因数（Ne）和多态信息含量（PIC）是评价群体内遗传多样性的指标。哈萨克羊属于低度多态（PIC<0.25）（表2）。χ2适合性检验表明处于Hardyweinberg平衡状态（P>0.05）。

表2 755bp处基因型频率和基因型频率

对哈萨克羊群体BMP15基因第755位点的纯合度、杂合度、有效等位基因数以及多态信息含量进行统计分析，表3计算结果表明，在哈萨克羊群体中PIC属于低度多态。

表3 BMP15基因多态位点多态性参数分析

2.5 不同基因型在哈萨克羊群体中分布的差异显著性检验

群体AA，AB两种基因型与产羔数显著性检验结果，表明携带基因型AA与AB群体之间产羔数差异显著（P<0.05）。产羔数平均值表现为：AB>AA（表4）。

3 讨论

3.1 基因的遗传特性

在对719个哈萨克羊样本进行检测分析时，BMP15基因发现AA、AB基因，优势基因型为AA型，优势等位基因为A基因，没有发现BB基因型的个体，这可能是被检测的品种中BB基因型突变频率太低或者BB基因为致死基因从而使得个体不能存活[8]。遗传多态分析表明，多态信息含量小于0.25，属于低度多态；χ2适合性检验表明：处于Hardy-weinberg平衡状态，说明该地区自然选择或者人工选择对该基因分布的影响较小，在遗传漂变、迁徙和人工选育等因素下保持动态平衡。

表4 BMP15不同基因型产羔数的最小二乘平均值及标准误

3.2 基因多态性与生产性状的关系

近年来，国内外关于绵羊BMP15基因多态性的研究报道比较多，且主要集中在对高繁殖力绵羊品种小尾寒羊、湖羊等品种的研究，而对于低繁殖力的哈萨克羊突变位点多态性的研究报道比较少。本实验利用PCR-RFLP、PCR-DS方法，对哈萨克羊群体BMP15基因进行了多态性检测。结果发现：哈萨克羊群体中BMP15基因FecXG和FecXB位点均未出现多态性，这与Galloway等[2]发现了Inverdale绵羊BMP15基因的FecXG突变和Hanna绵羊BMP15基因的FecXB突变结果有差异，可能是由于不同绵羊品种的产羔数差异导致的这个差异的原因。测序结果表明：AB型个体在该基因第二外显子第755位点发生G→A的突变，出现G/A的杂合。本研究中发现的突变为同义突变，没有引起相应氨基酸序列的变化，但由于碱基序列发生了变化，因此会影响基因的翻译速度，从而影响该基因的表达质量，甚至会导致蛋白质的空间结构的变化，从而影响其功能的发挥[9]。因此推断，BMP15基因第755位点的突变可以作为控制哈萨克羊多胎产羔的潜在遗传标记位点，需要进一步进行深入的研究。

4 结论

4.1 BMP15基因FecXG、和FecXB位点的多态性

通过PCR-RFLP检测BMP15基因的FecXG、和FecXB位点，结果发现这两个位点在哈萨克羊群体中不存在多态性，表明BMP15基因的FecXG、和FecXB位点的多态性与哈萨克羊产羔数没有相关性。

4.2 BMP15基因第二外显子第775突变位点的多态性

运用PCR-DS方法对719个哈萨克羊样本的BMP15基因第2外显子进行多态性检测，在第755位点均有G和A的杂合出现，没有发现突变纯合体。在BMP15基因的相关分析中，不同基因型AA和AB群体的产羔数之间差异显著。

参考文献

[1]田秀娥，孙红霞，王永军.3个绵羊群体BMPR-IB基因的遗传多态性及其对产羔数的影响[J].西北农林科技大学学报：自然科学版，2009,11（37）：31-36.

[2]Galloway S M，McNatty K P，Cambridge L M，et al.Mutations in anoocyte-derived growth factor gene（MBP15）are associated with both increased rate and sterility in Cambridge and Belclare sheep[J].Biology of Reproduction，2004，70（4）：900-909.

[3]Hanrahan J P，Gregan S M，Mulsant P，et al.Muantions in the genes for oocyte-derived groeth factors GDF9 and BMPR15 are associated with both increased ovulation rate and sterility in Cambridge and Belcalaer sheep ，Biol Reprod.2004，70：900-909.

[4]Bodin L，Di Pasquale E，Fabre S，et al.A novel mutation in the BMPR15 gene causing defective protion secretion is Lacaune sheep[J].En-docrinology，2007，148（1）：393-400.

[5]Monteagudo L V，Ponz R，Tejedor M T.A 17 bp deletion in the bone morphogenetic protein 15（BMPR15）gene is associated to increased prolif cacy in the Rasa Aragonesa sheep breed[J].Animal Reproduction Science，2009，110：139-146.

[6]Martinez-Royo A，Jurado J J，Smulders J P.A deletion in the bone morphogenetic protein 15 gene cause sterility and increased prolicacy in Rasa Aragonesa sheep[J].Animal Genetics，2008，39（3）：294-297.

[7]赵有璋.羊生产学[M].北京：中国农业出版社，2000.

[8]Davis G H.fecunity genes in sheep[J].Animal Reproduction Science，2004：82-83.

[9]Kimchi-Sarfaty C，Oh J M，Kim I W，et al.A“Silent”polymorphism in the MDR1 gene changes substrate specif city[J].Animal Science，2007，315（5811）：525-528.

（编辑：张淑凤）

S813.3

B

1006-799X(2016)24-0103-04

哈萨克羊多胎（多羔）基因检测项目（YZ201502018）。

陈春华（1987-），女，新疆昭苏县人，畜牧师，主要研究方向为动物遗传育种与繁殖。

杨光维（1981-），男，湖北咸丰人，高级畜牧师，主要研究方向为动物遗传育种与繁殖。