益气化痰方对慢性阻塞性肺疾病小鼠肺功能及IL-17、TNF-α的影响

詹少锋，单丽囡，冯立志

1.广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 510405；2.广州中医药大学，广东 广州 510006

益气化痰方对慢性阻塞性肺疾病小鼠肺功能及IL-17、TNF-α的影响

詹少锋1，单丽囡2，冯立志2

1.广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 510405；2.广州中医药大学，广东 广州 510006

目的：观察益气化痰方对慢性阻塞性肺疾病小鼠的肺功能及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-17（IL-17）的影响。方法：将60只C57BL小鼠随机分成6组，分别是正常对照组、COPD模型组、低剂量中药组、中剂量中药组、高剂量中药组、地塞米松组，每组10只。香烟烟熏方法建立慢性阻塞性肺疾病小鼠模型，给药后分别观察小鼠肺功能以及对肺泡灌洗液中TNF-α、IL-17的变化。结果：与正常对照组相比，COPD模型组吸气峰流量（PIF）、呼气峰流量（PEF）及每分钟通气量（MV）数值均降低，差异均有统计学意义（P＜0.01），低、中、高剂量的益气化痰方均能明显改善COPD小鼠气道的高反应状态，差异均有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05）。与COPD模型组比较，中、高剂量组肺泡灌洗液中IL-17和TNF-α逐渐降低，差异均有统计学意义（P＜0.01）。结论：益气化痰方能明显改善COPD小鼠的气道高反应，同时降低气道炎症反应。

慢性阻塞性肺疾病；益气化痰方；肺功能；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-17（IL-17）；动物实验

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是我国呼吸系统的常见病、多发病，患病率居高不下，目前尚无确切方法阻断慢性阻塞性肺疾病肺功能下降的进程。虽然现代医学治疗方法在本病急性加重期较为多样化和效果显著，但从本病全程防治来讲，中医药疗法仍然有重要的地位和作用。主要体现在稳定期扶助正气，减少未来急性加重急性发作次数和风险，提高运动耐量，减少合并症和改善生活质量[1]。本研究从中医学“肺主气”“肺主通调水道”的理论出发，通过观察益气化痰方对肺功能及气道炎性作用，探讨益气化痰方对COPD可能的作用机制，结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物分组 60只C57BL小鼠(广州中医药大学实验动物中心)，适应性饲养1周，随机分为6组，每组10只，分别为正常对照组，COPD模型组，低剂量中药组，中剂量中药组，高剂量中药组，地塞米松组。

1.2 试剂 小鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)(上海依科赛生物制品有限公司)、白细胞介素-17(IL-17)ELISA试剂盒(上海依科赛生物制品有限公司)。

1.3 方药组成及制备 益气化痰方选自(《时氏医道》保元汤)：由黄芪、党参、炙甘草组成；合二陈汤(取自《太平惠民和剂局方》)：由陈皮、半夏、茯苓组成。具体实验动物用药量折算标准如下[2]：小鼠(20 g)用量 =中药总量 /人的剂量× 0.0028=0.147 g；0.147/2 mL=0.735 g/mL，即为中剂量；0.147 g/mL即为高剂量；0.367 g/mL即为低剂量。中药煎剂制作过程如下：将上方中药置8倍温水中浸泡0.5 h，沸腾后文火煎煮4 h，注意均匀搅拌，取汁后经三层纱布过滤；第2次和第3次煎煮均分别以6倍水文火煎煮2 h，同样方法取汁，合并3次药液，置水浴箱内浓缩。药液常温冷却后，至4℃冰箱内保存备用。

1.4 COPD小鼠模型建立 采用熏烟的方法建立小鼠COPD模型[3]，将小鼠置于PAB-S200被动吸烟动物染毒系统的染毒箱内，箱体的顶部有两个1.5 cm×1.5 cm的小孔，可以让箱体内空气与箱外保持相通，有效避免箱内的小鼠因缺氧而导致死亡。点燃10根椰树牌香烟(焦油量12 mg，烟气烟碱量1.2 mg，烟气一氧化碳量14 mg)，放入染毒箱内，关闭染毒箱，1 h后将小鼠取出，休息15 min后，再次点燃10根香烟，将小鼠继续放置染毒箱内1 h。每天熏烟1次，每次2 h，每周连续熏烟6天，熏烟20周。

1.5 方法 正常对照组小鼠，正常饲养，除生理盐水灌胃外，不加任何其他干预；COPD模型组小鼠，按照上述造模方法，连续熏烟20周；低、中、高剂量中药组小鼠，按照上述造模方法连续熏烟4周，第5周开始，每天在熏烟前1 h，低、中、高剂量中药组小鼠分别按照0.147 g/mL、0.735 g/mL、0.367 g/mL的3个剂量给予灌胃益气化痰中药汤剂处理，给药处理一直持续16周到实验结束；地塞米松组小鼠则在熏烟处理的第5周开始，每天在熏烟前30 min，按照10 μg/10 g体重的剂量腹腔注射地塞米松针剂，一直持续16周到实验结束。

1.6 肺功能检测 小鼠肺功能测定：采用Buxco的非束缚清醒动物全身体积描记系统检测各组小鼠的肺功能，具体检测指标为吸气峰流量(peak inspiratory flow，PIF)、呼气峰流量(peak expiratory flow，PEF)及每分钟通气量(minute volume， MV)。

1.7 肺泡灌洗液检测 小鼠支气管肺泡灌洗液((Bronchial Alveolar Lavage Fluid，BALF)的收集及处理：用细棉线在左肺门根部结扎左侧肺叶。在胸部切口处向上沿正中线剪开颈部皮肤，钝性分离软组织，暴露气管，在甲状腺位置做T型切口切开气管，用头皮留置针的塑料管做气管插管，用注射器吸取PBS溶液0.5 mL通过插管缓慢注入右肺，可见右侧肺部逐渐膨胀，颜色由暗红色变成粉白色，待所有PBS注入完毕，轻轻按摩肺部，10 s后回抽液体，重复此过程2次，回收率在80%左右，回抽的液体放入1.5 mL无菌EP管中，1500 rpm，离心10 min，将上清转移到EP管，-80℃冷冻保存。

2 统计学方法

3 结果

3.1 基本情况 在建模开始前，模型组和对照组小鼠体质量差异无统计学意义(P＞0.05)，建模开始后对照组小鼠体质量呈稳定上升趋势，而建模组小鼠在熏烟开始的第1月精神萎靡、厌食水，体质量进行性下降，直到1月之后才逐渐适应，体质量缓慢上升，至建模成功的6月后模型组小鼠和对照组小鼠体质量比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。

3.2 各组小鼠肺功能数值情况比较 见表1。与正常对照组比较，COPD模型组PIF、PEF和MV均降低，差异均有统计学意义(P＜0.01)；与COPD模型组比较，低、中、高剂量中药组PIF，差异均有统计学意义(P＜0.01，P＜0.05)。低、中、高剂量中药组PEF和MV比较，差异均有统计学意义(P＜0.01)。地塞米松组PIF、PEF和MV，差异均无统计学意义(P＞0.05)。

表1 各组小鼠肺功能数值情况比较()

表1 各组小鼠肺功能数值情况比较()

与正常对照组比较，①P＜0.01；与COPD模型组比较，②P＜0.05，③P＜0.01

组别正常对照组C O P D模型组低剂量中药组中剂量中药组高剂量中药组地塞米松组n 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 P I F ( m L / s ) 4 . 4 9 ± 0 . 2 3 2 . 7 3 ± 0 . 2 7①2 . 9 7 ± 0 . 1 9②3 . 2 1 ± 0 . 2 3③3 . 4 4 ± 0 . 1 3③2 . 6 5 ± 0 . 1 4 P E F ( m L / s ) 3 . 2 0 ± 0 . 1 5 1 . 8 3 ± 0 . 1 8①2 . 0 2 ± 0 . 1 6③2 . 2 3 ± 0 . 1 6③2 . 4 8 ± 0 . 1 0③1 . 9 4 ± 0 . 1 5 M V ( m L / s ) 3 8 . 9 0 ± 2 . 3 9 2 5 . 3 1 ± 1 . 9 9①2 9 . 0 5 ± 1 . 9 4③3 2 . 3 3 ± 1 . 4 4③3 5 . 1 ± 0 . 8 6③2 5 . 9 4 ± 1 . 7 6

3.3 各组小鼠BALF中IL-17和TNF-α含量情况比较 见表2。与正常对照组比较，COPD模型组BALF中IL-17和TNF-α，差异均有统计学意义(P＜0.01)；与COPD模型组比较，低、中、高剂量中药组及地塞米松组BALF中IL-17，差异均有统计学意义(P＜0.01)；中、高剂量中药组及地塞米松组BALF中TNF-α，差异均有统计学意义(P＜0.01)。

表2 各组小鼠BALF中IL-17和TNF-α含量情况()pg/mL

表2 各组小鼠BALF中IL-17和TNF-α含量情况()pg/mL

与正常对照组比较，①P＜0.01；与COPD模型组比较，②P＜0.01

组别正常对照组C O P D模型组低剂量中药组中剂量中药组高剂量中药组地塞米松组n 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 I L -1 7 1 8 . 9 6 ± 5 . 8 1 1 5 8 . 8 1 ± 2 0 . 3 0①1 2 1 . 0 8 ± 1 8 . 0 0②9 8 . 0 0 ± 1 2 . 6 9②6 6 . 2 2 ± 1 3 . 0 3②4 0 . 8 1 ± 1 0 . 1 5②T N F -α 2 2 . 0 5 ± 4 . 3 3 1 5 1 . 2 2 ± 3 0 . 0 0①1 2 3 . 1 1 ± 2 2 . 7 9 9 2 . 8 0 ± 1 5 . 5 6②5 3 . 9 4 ± 1 5 . 5 1②3 7 . 8 6 ± 1 0 . 6 9②

4 讨论

慢性阻塞性肺疾病是一种气流受限的慢性气道炎症性疾病。有毒颗粒或气体(如香烟烟雾、生物燃料等)刺激支气管黏膜上皮，募集中性粒细胞、巨噬细胞等天然免疫细胞，并进一步激活获得性免疫细胞，天然免疫与获得性免疫协同作用，造成持续的炎症损伤与异常修复，从而造成不可逆性气流受限，导致黏液高分泌状态[2]。目前认为，COPD的发病是由遗传、环境、感染及免疫等多因素相互作用所致，己知气道免疫系统异常所致的炎症反应在COPD发病中起着重要作用，其中细胞炎症因子是多种气道类疾病如哮喘、COPD和肺部感染的重要介质之一。研究发现，Th17细胞及其分泌的细胞因子IL-17在COPD发病机制中发挥着关键调控作用[4]。

IL-17具有强大的致炎和免疫趋化的作用，能够诱导早期炎症发生，使气道中性粒细胞募集和活化增强，促进气道炎症的发生[5]。IL-17还可协同活化的巨噬细胞产生TNF-α，进一步放大炎症反应，刺激支气管上皮杯状细胞与黏膜下腺体使黏液分泌增加，导致气流受限，从而在气道重塑中发挥作用[6]。研究发现，在COPD小鼠模型的BALF及肺组织中IL-17浓度较正常组升高，且肺组织中IL-17的浓度与BALF的中性粒细胞百分比呈正相关[7]。使用IL-17气道给药刺激后，支气管肺泡灌洗液中中性粒细胞的绝对数量增加，但以IL-17中和抗体预处理的小鼠组肺灌洗液中中性粒细胞绝对数量则显著减少。IL-17是中性粒细胞强效的活化剂，研究发现IL-17能够上调趋化因子的表达升高，招募中性粒细胞和炎症因子到达靶部位，从而造成感染部位的组织破坏[8]。本研究结果提示，益气化痰方能够降低COPD小鼠BALF的IL-17、TNF-α的含量，减轻COPD小鼠肺组织病理损害，保护肺通气功能。随着炎症指标的改善，益气化痰方可以降低COPD小鼠肺通气功能PIF、PEF和MV数值，从而改善COPD小鼠气道的气流受限状态。

根据COPD的中医病因病机特点，外邪袭肺或痰浊阻肺，引发咳喘，久咳久喘必伤肺气，肺气耗伤，宣肃无力，通调失司，又致痰浊内生，如此肺虚与痰浊互为因果，往复无端循环，迁延不愈，故气虚痰阻贯穿整个疾病过程。肺胀病既是肺气虚痰阻的结果，又是再致肺气耗伤的直接原因。因此，益气化痰方治疗肺之本虚兼以痰阻标实，有利于肺气的恢复。

综上所述，通过对COPD中西医学特点的剖析，探讨益气化痰中药对COPD小鼠模型气道炎症、气道高反应性的调节作用，深入挖掘中医药疗法的优点，并结合现代医学进行研究作用机制，为中医“肺主气”“肺主通调水道”理论与益气化痰治法的科学内涵提供实验依据。同时这对于发挥中医药治疗优势，提高本病的防治效果有着重要的现实意义。

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（责任编辑：刘淑婷）

R285.5

A

0256-7415（2016）03-0221-03

10.13457/j.cnki.jncm.2016.02.087

2015-11-20

广东省中医药局项目（20121231）；广州中医药大学邓铁涛基金项目（25012604）

詹少锋（1979-），男，医学博士，主治医师，研究方向：中医药防治慢性阻塞性肺疾病。