肺炎克雷伯菌ESBLs基因型分布与耐药相关性研究

付娟娟　庞　峰　李艳华　咸庆杰　李波清



肺炎克雷伯菌ESBLs基因型分布与耐药相关性研究

付娟娟1，2庞峰2李艳华2咸庆杰2李波清1

【摘要】目的 研究聊城地区呼吸道感染患者中产ESBLs肺炎克雷伯菌相关耐药基因的分型及不同基因型与抗生素耐药性关系。方法 收集2015年10～12月本院137例肺炎克雷伯菌阳性痰标本，比较分析基因型对抗生素的耐药性的关系。结果 产ESBLs菌株对头孢他啶、头孢曲松、头孢噻肟、头孢吡肟和氨曲南的耐药率与非ESBLs菌株相比，差异有统计学意义（P＜0．05）；CTX-M型阳性菌株与阴性菌株相比，对抗生素头孢曲松、头孢噻肟和氨曲南耐药率差异有统计学意义（P ＜0．05）；SHV型阳性菌株与阴性菌株相比，对抗生素头孢他啶和哌拉西林/他唑巴坦耐药率差异有统计学意义（P＜0．05）。结论 通过检测肺炎克雷伯氏菌产ESBLs酶和ESBLs基因，分析ESBLs基因本院流行情况及常见基因与抗生素耐药关系，为指导临床医师合理用药提供可靠依据。

【关键词】呼吸道细菌感染；肺炎克雷伯菌；抗生素

作者单位： 1 滨州医学院基础医学院，山东 烟台 264003；2 聊城市人民医院检验科，山东 聊城 252000

近年来，随着抗生素的大量不规范使用，特别是β内酰胺类抗生素、免疫抑制剂、肿瘤化疗等药物的广泛应用，产ESBLs肺炎克雷伯菌日趋增多，由于各地区、各医院抗菌药物使用情况差异较大，产ESBLs菌株的流行情况和基因型的分布亦存在较大差异［1］。本研究以2015年10～12月本院137例肺炎克雷伯氏菌阳性痰标本作为研究对象，探究其肺炎克雷伯菌的产ESBLs菌株的检出率、耐药性情况、基因型分布及不同基因型ESBLs与抗生素耐药性的关系等问题，旨在得出更为全面的克雷伯菌的ESBLS基因分型及耐药性情况，为后续的耐药性监测、医院感染控制、临床抗感染用药等方面提供良好的研究依据。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株 选取本院2015年10～12月收治的呼吸道感染患者中痰标本培养出肺炎克雷伯菌的137例患者作为研究对象，收集这137株肺炎克雷伯菌菌株作为试验菌株。

1.1.2试剂 抗生素纸片、MH肉汤培养基和MH琼脂培养基（广州迪景）；AST-GN13药敏卡（法国梅里埃）；ESBLs耐药基因TEM、CTX-M和SHV引物均由上海的英骏合成提供；小量质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒（QIAGEN公司）。

1.1.3仪器 VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定及药敏分析系统；Thermo Forma 二氧化碳细胞培养箱；Gene Amp PCR System 9700；Bio-rad核酸电泳仪等。

1.2方法

1.2.1VITEK 2-compact全自动分析系统检测初筛ESBLs阳性菌株将临床分离菌株严格参照GNI鉴定卡、AST-GN 13药敏卡说明书要求操作，利用VITEK 2-compact全自动分析系统进行检测。仪器检测AST-GN 13药敏卡的ESBLs 6个检测孔（头孢噻肟与头孢噻肟+棒酸、头孢他啶与头孢他啶+棒酸、头孢吡肟与头孢吡肟+棒酸）的生长浊度变化加棒酸的孔细菌生长浊度减少50％或以上，判定为ESBLs阳性；将筛选出ESBLs阳性菌株-20℃冰箱保存备用。

1.2.2 双纸片表型确证试验 双纸片扩散法确证试验确定ESBLs阳性菌株，结果判断标准参照CLSI文件M100-S23（2013年）推荐的标准。以大肠埃希菌ATCC25922和肺炎克雷伯菌 ATCC700603为标准质控菌株。

1.2.3ESBLs阳性菌株DNA的提取 将确定的ESBLs阳性菌株从-20℃冰箱取出，刮取少量菌液接种于l ml的LB液体培养基中，37℃恒温过夜；将过夜培养的1 ml菌液置于1.5 ml Eppendof管中，采用德国QIAGEN公司的小量质粒提取试剂盒，操作过程严格按照说明书进行，将产物置于-20℃冰箱保存备用。

1.2.4统计学处理 应用列联表统计分析工具V1处理数据，率采用χ2检验或精确概率法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1产ESBLs肺炎克雷伯菌菌株的检出情况

137例肺炎克雷伯菌阳性菌株中，VITEK MS和VITEK2 COMPACT全自动分析系统上机检测ESBLs阳性菌株43株，双纸片扩散法确证试验亦是43株ESBLs阳性菌株，检出率32.1％。

2.2耐药性

产ESBLs菌株对头孢他啶、头孢曲松、头孢噻肟、头孢吡肟和氨曲南的耐药率分别是46.51％、65.12％、62.79％、37.21％和 69.77％，与非ESBLs菌株（25.53％、36.17％、15.96％、19.15％和25.53％）相比，差异有统计学意义（P＜0.05）；产ESBLs与非产ESBLs菌株相比，均对美罗培南、亚胺培南、厄他培南、头孢替坦和阿米卡星比较敏感，差异无统计学意义（P＞0.05）；产ESBLs菌株对氨苄西林耐药率为100％，非产ESBLs菌株对氨苄西林耐药率为98.94％，两者差异无统计学意义（P＞0.05）；其他抗菌药物，产ESBLs与非产ESBLs菌株相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3PCR检测结果

TEM基因扩增产物在电泳图上在1 094 bp左右见图2；SHV基因扩增片段在865 bp左右见图3；CTX-M基因扩增片段在814 bp左右。

2.4确认基因分型

经表型试验确认有43株产ESBLs阳性菌株，TEM、SHV和CTX-M基因扩增产物阳性株有42株，1株为阴性。42株阳性株检出CTX-M型36株，SHV型26株、TEM型6株、TEM 和SHV复合型2株、CTX-M和SHV复合型10株、CTX-M、SHV和TEM复合型1株。

2.5不同耐药相关基因型对抗生素的耐药率分析

在137株肺炎克雷伯氏菌菌株中，CTX-M型36株（6.3％），SHV型26株（19.0％），TEM型6株（4.4％）；CTX-M型阳性菌株与CTX-M型阴性菌株相比，对头孢曲松（72.22％ vs.35.64％）、头孢噻肟（61.11％vs.19.80％）和氨曲南（72.22％ vs.27.72％）耐药率差异有统计学意义（P＜0.05）；SHV阳性与SHV阴性菌株相比，对头孢他啶（61.54％ vs 25.23％）和哌拉西林/他唑巴坦（50.00％ vs.17.12％）耐药率差异有统计学意义（P＜0.05）；TEM阳性与TEM阴性菌株相比，对头孢他啶（83.33％ vs.29.77％）耐药率差异有统计学意义（P＜0.05）；在其他抗生素（美罗培南、亚胺培南、厄他培南、阿米卡星、庆大霉素、环丙沙星、头孢哌酮/舒巴坦等）差异无统计学意义（P ＞0.05）。

CTX-M型阳性菌株对头孢噻肟耐药的菌株占61.1％，而对头孢他啶耐药的菌株仅占30.6％；相反，SHV型阳性菌株对头孢他啶耐药的菌株占61.5％，对头孢噻肟耐药的菌株仅占46.2％，TEM型阳性菌株对头孢他啶耐药的菌株占83.3％，孢噻肟耐药的菌株仅占33.3％；对抗生素头孢曲松耐药率，CTX-M型阳性菌株（72.2％）高于SHV型阳性菌株，高于TEM型阳性菌株。

3　讨论

由于临床抗生素广泛使用，三代头孢的耐药率及产ESBLs的菌株检出率逐年增高，在美国，不同医院中肠杆菌科细菌ESBLs的检出率为0％～25％，平均为3％，在国内，据刘露报道［2-4］我国11个地区肺炎克雷伯菌产ESBLs检出率为17.6％～60％，本次研究从吸道疾病患者痰标本中选取肺炎克雷伯菌阳性菌137株，通过VITEK2 COMPACT全自动细菌鉴定及药敏分析系统上机检测初筛ESBLs阳性菌株43株，双纸片扩散法试验确证ESBLs阳性菌株43株，检出率为32.1％，提示产ESBLs菌株流行情况已经很严重。

经表型确证试验确认有43株产ESBLs阳性肺炎克雷伯菌菌株，而TEM、SHV和CTX-M基因扩增产物阳性株有43株，1株为阴性。阴性菌株重复3次表型确证试验和3次TEM、SHV和CTX-M基因扩增，结果表型确证试验依然阳性，而扩增依然阴性。研究表明，这43株产ESBLs阳性菌株中有一株ESBLs基因型是除外TEM、SHV和CTX-M基因的其他基因型。产ESBLs菌株在临床上的流行情况因地域差别有所不同，不同地区基因型的分布亦存在较大差异［5-6］。本次研究本地区流行的ESBLs基因型以CTX-M和SHV型为主，另外，有10株存在CTX-M和SHV型，2株存在TEM和SHV型，1株存在CTX-M、SHV和TEM型，原因可能细菌质粒上同时携带两种或者三种ESBLs编码基因［7-8］。

对头孢噻肟耐药率低于对头孢他啶说明本地区SHV基因型ESBLs还是以头孢他啶酶为主。比较CTX-M与SHV型ESBLs对抗生素的耐药情况，发现本地区，两基因型均对美罗培南、亚胺培南等碳青霉烯类抗生素比较敏感；均对阿米卡星和头孢替坦保持比较高的敏感性；对第三代头孢菌素耐药率：CTX-M型ESBLs对头孢噻肟的耐药率远高于头孢他啶，SHV型ESBLs对头孢他啶的耐药率远高于头孢噻肟；对头孢曲松耐药都很高；对部分第四代头孢菌素耐药率升高，如头孢吡肟；ESBLs通常为质粒介导，质粒很容易在不同细科之间传播，累积多种耐药基因，从而使细菌的质粒携带多种耐药基因，造成细菌产生多重耐药。所以针对本地区的呼吸道感染患者，不要盲目使用抗生素，尽量待药敏结果出来，根据药敏结果选用抗生素，如果经验性治疗，尽量避免使用青霉素类、三代头孢菌素和氨曲南，可选用碳青霉烯类抗生素、阿米卡星和头孢替坦等药物；尽量避免抗生素的过度和不合理使用而导致多重耐药的产生，控制耐药菌株的扩散和流行。

参考文献

［1］倪小清，姬小丽，刘小康． 产ESBLs肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌的耐药性分析及TEM基因测序［A］． 中国药理学会第十一届全国化疗药理学术研讨会论文集［C］． 北京：中国药理学会化疗药理专业委员会，2012．

［2］刘露，陈国强． 全国11个地区肺炎克雷伯菌产超广谱β-内酰胺酶及其耐药性分析［J］． 中华医院感染学杂志，2005，15（9）：1064-1066．

［3］邱星安． 肺炎克雷伯菌的耐药趋势及耐药机制的研究进展［J］．中国现代药物应用，2011，5（5）：236-238．

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［7］叶惠芬，陈惠玲，刘平，等． 产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌耐药性和基因型分布［J］． 中国感染与化疗杂志，2007，7（2）：127-129．

［8］陈聪． 40株PMQR基因阳性大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中ESBLs流行特征的研究［D］． 合肥：安徽医科大学，2013：11-12．

·临床研究·

Study on the Relationship Between ESBLs Genotype Distribution and Drug Resistance of Klebsiella Pneumoniae

FU Juanjuan1，2PANG Feng2LI Yanhua2XIAN Qingjie2LI Boqing11 Department of Basic Medical Sciences， Binzhou Medical University， Yantai

Shandong 264003， China， 2 Department of Laboratory， Liaocheng People′s Hospital， Liaocheng Shandong 252000， China

［Abstract］Objective To study the genotype and antibiotic resistance of ESBLs Klebsiella pneumoniae in patients with respiratory tract infections in Liaocheng area. Methods Collected 137 cases of Klebsiella pneumoniae positive sputum samples from October to December 2015 in our hospital，and analyzed the relationship between genotype and antibiotic resistance. Results The ESBLs producing strains to ceftazidime， ceftriaxone，cefotaxime， cefepime and aztreonam resistance rate compared with non ESBLs strains， the difference was statistically significant （P＜0.05）， type CTX-M positive strains compared with negative strains in ceftriaxone，cefotaxime and aztreonam resistance rate significantly the difference of antibiotic （P＜0.05）， type SHV positive strains compared with negative strains， antibiotic ceftazidime and piperacillin / tazobactam resistance rate was significantly difference （P＜0.05）. Conclusion The detection of Klebsiella pneumoniae producing ESBLs enzyme and ESBLs gene，ESBLs gene analysis of the epidemic situation and the common genes and antibiotic resistance， and provide a reliable basis for guiding the rational drug use.

［Key words］Bacterial infection of respiratory tract， Klebsiella pneumonia，Antibiotic

【中图分类号】R978．1

【文献标识码】A

【文章编号】1674-9308（2016）12-0111-03

doi：10．3969/j．issn．1674-9308．2016．12．080

通讯作者：李波清，E-mail：sdliboqing@163．com