超声微泡破裂法促进骨形态发生蛋白-2在大鼠骨髓间充质干细胞表达的研究

刘永恒　王东　李岩　段志青　郭丽



超声微泡破裂法促进骨形态发生蛋白-2在大鼠骨髓间充质干细胞表达的研究

刘永恒1王东2李岩1段志青3郭丽3

【摘要】目的 探讨超声微泡破裂法对基因重组人骨形态发生蛋白-2（rhBMP-2）质粒GV 147-rhBMP 2-GFP在大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的转染、表达的促进作用。方法 选取8周龄Sprague-Dawley雄性大鼠分离培养BMSCs，传至第3代时胞悬液分为3组：A组（单纯细胞组），B组（质粒组，仅加质粒GV 147-rhBMP 2-GFP）及C组（超声+微泡+质粒组）；转染后48h用倒置荧光显微镜观察质粒转染情况及细胞生长状况，RT-PCR检测细胞转染后的目的基因表达。对数据进行分析。结果 48h后可在倒置荧光显微镜下，观察到质粒组及超声+微泡+质粒组部分细胞胞浆内发出绿色荧光，其中单纯细胞组未见绿色荧光，超声+微泡+质粒组的绿色荧光表达量高于B组；RT-PCR检测显示C组BMP-2基因mRNA相对表达量较B组高。结论 超声微泡破裂法能增加外源性rhBMP-2基因在大鼠骨髓间充质干细胞转染率和表达水平，有望为骨折的基因治疗提供一种新型方法。【关键词】超声；微泡；基因治疗；人骨形态发生蛋白-2；骨髓间充质干细胞

作者单位：1 030001太原，山西医科大学；2 030001太原，山西医科大学第二医院骨科；3 030001太原，山西医科大学第二医院骨与软组织损伤修复山西省重点实验室

骨形态发生蛋白（Bone Morphogenetic Proteins，BMP）属于β转化生长因子超家族成员，骨生长的启动因子，其中BMP-2是最主要的骨形成调节因子［1-2］。含BMP-2基因的质粒转染骨髓间充质干细胞BMSCs的转染率较低。超声微泡破裂法在基因治疗领域有较高应用价值，可以安全有效地促进目的基因转移，提高外源基因转染率和表达水平［3］。本实验在超声微泡破裂法作用下，将重组人骨形态发生蛋白-2（Recombinant Human Bone Morphogenic Protein-2，rhBMP-2）基因，通过质粒转染大鼠骨髓间充质干细胞BMSCs，观察其对大鼠BMSCs表达的影响。

1　实验材料与方法

1.1实验材料

（1）实验动物：8周龄健康Sprague-Dawley 大鼠3只，体重约180g，雄性（山西医科大学实验动物中心提供）。（2）质粒构建：携带重组人骨形态发生蛋白-2（rhBMP-2）和绿色荧光蛋白（Green Fluorescence Protein，GFP） 基因的质粒GV 147-rhBMP 2-GFP（上海吉凯公司协助构建）。（3）主要试剂：Promega Go Taq®qPCR Master Mix，（A 6 001）200 Reactions（普洛麦格公司，美国）；Promega，Go ScriptTMReverse Transcription System，Promega A 5 000，50 reactions（普洛麦格公司，美国）；注射用六氟化硫微泡（声诺维）（瑞士Bracco Suisse SA上海博莱科信谊药业有限责任公司分装）；RT-PCR引物（英潍捷基上海贸易有限公司）。（4）主要仪器与设备：超声治疗仪（Mark 3，EMS Limited，Oxford）；倒置相差显微镜（U-LH00HG，Olympus 公司产品，德国）；Bio-Rad C 1 000 Thermal Cycler（北京友华照钦医疗器械有限公司）；Bio-Rad IQ 5 Multicolor Real-Time PCR（北京友华照钦医疗器械有限公司）。

1.2实验方法

1.2.1Sprague-Dawley大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的分离、培养 大鼠麻醉后处死，用75%酒精浸泡约10min，在无菌条件下取出股骨和胫骨，去除骨表面的软组织。用咬骨钳将两端干骺端切除，显露骨髓腔。用5ml注射器吸取DME/F-12彻底冲洗骨髓腔至白色，过滤后收集冲洗液。应用密度梯度离心和贴壁法分离目的细胞：骨髓悬液在室温下，以1 100 r/min离心3～4min；离心后去上清，用15%无噬菌体、低内毒素胎牛血清的DME/F-12完全培养液重悬，制成单细胞悬液，于37℃体积分数为5%的CO2饱和湿度培养箱中培养。倒置相差显微镜下观察细胞形态及其生长情况。此时细为原代细胞，当80%～90% 细胞融合时，传代培养，此时细胞为第1代。待细胞80%～90%融合后，重复上述步骤进行传代，细胞培养至第3代。

1.2.2实验分组（每组10孔）（1）A组：细胞未作任何处理。（2）B组：每孔加入6μg重组质粒，500μl不含血清培养基，室温孵育20min。（3）C组：质粒+微泡造影剂+超声辐照组，每孔加入6μg重组质粒，500μl浓度为10%的微泡造影剂，室温孵育20min，超声辐照条件同前。取第3代细胞，以转染倍数（MOI=25）行质粒转染，500μl 浓度为 10%微泡造影剂（含DME/F-12，不含血清），超声（频率2.0 MHz，机械指数0.28，时间30s），6h后每孔后加入换体积分数为15%胎牛血清的DME/F-12完全培养液，置于37℃、5% CO2饱和湿度培养箱中继续培养，倒置荧光显微镜下观察质粒转染情况及细胞生长状况。

1.2.3RT-PCR技术检测rhBMP-2基因mRNA表达 参照Gene Bank中基因的核酸序列进行引物设计。rhBMP-2引物序列：5’-ACCCGCTGTCTTCTAGCGT-3’（上游），5’-TTTC AGGCCGAACATGCTGAG-3’（下游）；GAPDH引物序列：5’-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3’（上游），5’-GCCATCA CGCCACAGTTTC-3’（下游）。Trizol法提取细胞总RNA。使用RNA分光光度计测RNA浓度并据此配平RNA量，按照Promega公司的反转录试剂盒说明书设置反转录条件并进行反转录。反转录完成后，取cDNA产物做模板，按试剂盒说明书配成每孔20μL的反应体系，启动Bio-Rad IQ 5 Multicolor Real-Time PCR相应程序并运行。

1.3统计学方法

所得数据使用SPSS13.0统计学软件进行处理分析，计量资料以（均数±标准差）表示，多组间比较采用方差分析，P＜0.05，差异具有统计学意义。

2　结果

2.1大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的形态学观察

刚接种时，细胞呈圆形，大部分悬浮于培养液中。12h开始贴壁，细胞呈圆形或椭圆形。48h后，大部分细胞贴壁，形态不一，呈梭形或多角形改变。第3d，细胞增殖，数量增多，出现散在的贴壁生长的成纤维样细胞。第5～7d，细胞数量增多，呈单层生长，细胞形态趋于一致，呈梭形。传代细胞24h内完全贴壁。第3代细胞呈均匀一致的梭形。

2.2基因表达检测

（1）荧光显微镜观察转染结果48h后可见A组无绿色免疫荧光，B组和C组有绿色荧光，C组多于B组，绿色荧光分布于整个骨髓间充质干细胞，呈胞质分布，说明质粒转染成功，重组质粒转染的rhBMP-2基因在大鼠骨髓间充质干细胞中成功表达。（2）RT-PCR 检测结果rhBMP-2基因mRNA相对表达量，超声+微泡+质粒组较质粒组组高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

3　讨论

骨髓间充质干细胞（BMSCs）是骨髓中具有高度自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞。其具有多向分化潜能，可以分化为为：成肌细胞、脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞［4］。体内和体外实验证实，骨形态发生蛋白（Bone Morphogenetic Proteins，BMPs）既可以促进成骨祖细胞分化为成骨细胞，又可以促进来自外周血的间充质干细胞分化为成骨细胞；同时动物体内实验验证［5］，骨形态发生蛋白对骨形成有促进作用。有促进成骨作用的骨形态发生蛋白是骨组织工程的重要成员［6-7］。其中rhBMP-2在临床骨科创伤的治疗中有重要作用，例如胫骨骨折、骨缺损、骨不连的治疗［8］。

多种方法可以将目的基因导入宿主，直接注射裸质粒是其中一种重要的方法，被应用于基因治疗。目前，如何提高低效的质粒转染是基因治疗的重要研究方向。最新研究发现一种有望成为其突破点的方法，可以提高目的基因转染率和表达水平的方法，用特定条件超声辐射，可作为体内基因转染载体的超声微泡造影剂，对目的基因转染有促进作用［9-10］。超声微泡破裂法的作用机制：微泡造影剂经特定条件的超声辐射可以产生“空化效应”，重复压缩膨胀的循环过程，同时微泡造影剂经还能减小超声辐射的空化阈值，加强其空化效应；一定强度的超声辐射可使微泡破损，促进基因从微泡中释放，细胞膜在超声辐射作用下有孔洞形成，有利于外源基因进入细胞［11-12］；研究证明［13-14］，超声微泡破裂法及其产生的微射流可以促进基因释放，从而为基因转染创造条件。

本实验课题是在超声微泡破裂法作用下将重组质粒GV 147-rhBMP 2-GFP转染大鼠骨髓间充质干细胞，观察质粒转染情况及其所含目的基因BMP-2的表达情况，为超声微泡破裂法应用于骨折的基因治疗奠定基础。本实验研究发现，重组质粒转染后48h，单纯重组质粒组和超声+微泡+质粒组均可在倒置荧光显微镜下观察到绿色荧光，但后者多于前者，证实质粒转染成功；RT-PCR检测结果显示，BMP-2基因mRNA的相对表达量在超声+微泡+质粒组多于单纯质粒组（P＜0.05），证明超声微泡破裂法能提高外源性rhBMP-2基因在大鼠骨髓间充质干细胞转染率和表达水平，有望为骨折的基因治疗提供一种新型方法。但由于实验条件限制，本实验仅在基因水平进行研究，后续实验需要在蛋白表达水平进行研究。

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Ultrasound-Mediated Microbubble Destruction Enhances Bone Morphogenetic Protein-2 Gene Expression in the Rat Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells

LIU Yongheng1WANG Dong2LI Yan1DUAN Zhiqing3GUO Li3，1 Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China.2 Department of Orthopaedics，The Second Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China.3 The Key Laboratory in Shanxi Provincial for Bone And Soft Tissue Injury Reapir，The Second Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

［Abstract］Objective To explore whether ultrasound-mediated microbubble destruction can enhance the expression of plasmid-GV147-rhBMP2-GFP for recombinant human bone morphogenic protein-2（rhBMP-2） in the rat bone marrow mesenchymal stem cells.Methods BMSCs of 8-week old male Sprague-Dawley rats were separated and cultured.In the 3rd passage，ells were divided into three groups：group A was without any treatment ，group B was given GV147-rhBMP2-GFP plasmid and ultrasound，group C was given GV147-rhBMP2-GFP plasmid and microbubbles plus ultrasonic irradiation.Forty-eight hours after transfection，the transient expression situation and the growth condition of cells was observed under inverted fluorescence microscopy.RT-PCR analysis was taken to evaluate the mRNA expression of BMP-2.Results Green fluorescence was observed in group B and C by fluorescence microscopy，which was negative in group A.The green fluorescence of group C was more than that of group B.RT-PCR assay showed that the mRNA expression of BMP-2 in group C was more than that in group B.Conclusion Ultrasound-mediated microbubble destruction could enhance the transfection and expression efficiency of rhBMP-2 gene in the rat bone marrow mesenchymal stem cells.It is a new gene therapy method for bone fracture.

［Key words］Ultrasound，Microbubble，Gene therapy，Human bone morphogenetic protein-2，Bone mesenchymal stem cells

【中图分类号】R-331

【文献标识码】A

【文章编号】1674-9308（2016）08-0028-02

doi：10.3969/j.issn.1674-9308.2016.08.019