四川省现行主推家蚕品种资源对BmNPV的抗性研究

袁桂阳 曹宁宁 王少伯 龚大刚 文廷勇 何艳茹

(1.四川省南充蚕种场，四川 南充 637000；2.四川省阆中蚕种场，四川 阆中 637400)

实验研究

四川省现行主推家蚕品种资源对BmNPV的抗性研究

袁桂阳1曹宁宁1王少伯1龚大刚2文廷勇1何艳茹1

(1.四川省南充蚕种场，四川 南充 637000；2.四川省阆中蚕种场，四川 阆中 637400)

BmNPV(核型多角体)病毒病是养蚕生产上最常见、危害最严重的一类蚕病，选育对BmNPV高抗力的家蚕品种是家蚕品种选育的主要攻关课题之一。为了摸清四川现行蚕品种资源对BmNPV的抗性以及和国内高抗BmNPV蚕品种的差异，本文通过人工经口添食BmNPV病毒的方法对川山、蜀水等20多个四川省主要家蚕品种的抗BmNPV性能进行了检测，旨在掌握不同品种对BmNPV抗性差异，筛选对BmNPV高抗性的育种素材，为选育BmNPV高抗病品种奠定基础。试验结果显示：不同品种对BmNPV抗性存在显著差异，其中 871C、872C对BmNPV的半数致死浓度(LC50)均达109p/mL以上，对BmNPV的抗性显著。其它品种对BmNPV的半数致死浓度(LC50)分布在104～105p/mL范围内，对BmNPV的抗性差异不明显。

蚕病 核型多角体 抗性 半数致死浓度

在影响养蚕生产的众多因素中，蚕病是最大的影响因素，往往导致大量病死蚕的发生，甚至绝收，严重影响养蚕效益和养蚕积极性，进而影响产业健康发展。据蚕病普查结果，养蚕损失中，70%来自蚕病，因家蚕病毒病所造成的损失约占总蚕病损失的70%～80%，而BmNPV病毒病又占到病毒病的60%以上。BmNPV病毒病是养蚕生产上最常见、危害最严重的一类蚕病。特别是20世纪80年代以来，BmNPV病毒病已成为我国主要蚕区危害最严重的蚕病。提高家蚕抗病性，培育高抗病蚕品种已成为家蚕育种的重要课题和蚕桑产业可持续发展的重要保障[1]。其中，BmNPV流行规律以及家蚕对BmNPV的抗性遗传规律研究是培育对BmNPV高抗病蚕品种，提高家蚕抗病性的理论基础。目前，对于BmNPV的传播流行规律已基本探明。随着家蚕基因组的破译，家蚕对BmNPV抗性遗传规律的研究也将取得更大突破。已有研究证明，不同蚕品种对BmNPV的抵抗性存在差异，为选育抗病品种奠定基础[2～3]。研究发现，家蚕对BmNPV的抗性为不完全显性遗传，既受常染色体上的主效基因控制，又受性染色体上相关基因的影响[4]。我们对我省现行主要品种资源进行了BmNPV抗性鉴定试验，测定了不同品种资源对BmNPV的半数致死浓度(LC50)，对于进一步研究BmNPV抗性遗传机制，选育抗BmNPV家蚕品种，抵御蚕病风险，促民增收和维持蚕桑产业可持续发展具有重要现实意义。

1 材料和方法

1.1 供试材料

1.1.1 蚕品种及来源

川山B、夏芳、932、芙蓉、871A、菁松A、限1、秋丰、苍松、碧海、蜀绣、蜀水B、秋白、7532、湘晖、872A、皓月A、限2、854B、日新、星月、渝春由四川省南充蚕种场繁育保存，871C、872C由中国蚕业研究所引进繁育。

1.1.2 核型多角体病原

原始BmNPV病原由中国农业科学院蚕业研究所提供，由我场对原始病原进行复壮、扩繁。

1.1.3 试验地点

四川省南充蚕种场蚕品种改良研究室试验组。

1.1.4 试验时间

BmNPV病原的复壮于2016年4月进行，BmNPV病原的扩繁于2016年5月进行，参试品种半致死浓度(LC50)测定于2016年6月进行。

1.2 方法

1.2.1 病毒复壮及扩繁

病原复壮采用经口添食的方法进行，家蚕3龄饷食第2次给桑时添食原始病毒。添食初始病毒浓度：1×107p/mL，采用25 mm打孔器打孔桑叶，打孔后的桑叶用塑料勺子将初始病毒BmNPV 50 uL均匀涂抹在桑叶上，给桑，采用常规饲育操作饲养，观察添食病毒蚕的生长发育情况。收集典型脓病病死蚕，先用研钵将其磨碎，用双层纱布过滤2次。然后将收集的过滤液，4000 rpm离心10 min，去上清；重复离心3次，收集沉淀，4℃保存，备用。

病毒扩繁采用注射方式进行，5龄饷食第2次给桑后，将以上复壮后的NPV病毒注射到家蚕腹部8～9环节，每头家蚕注射2 uL。接种病毒4、5d后，待大批发病时，收集病蚕，用解剖剪将蚕腹足全部剪掉，将蚕放于双层纱布上自然流出蚕血并进行过滤，滤去杂质，将收集的蚕血，800 rpm离心10 min，去沉淀，重复离心3次。将收集的上清液4000 rpm离心10 min，去上清；加入纯净水，搅拌，再用4000 rpm离心10 min。重复离心3次，去上清，收集沉淀，4℃保存，备用。

1.2.2 病毒计数

用血球计数器对制备病毒样品进行计数，4℃保存，备用。要求病毒浓度达到1.0×109p/mL以上，病毒使用前要重新进行计数，误差要求控制在相同数量级范围之内。

1.2.3 不同品种对BmNPV半数致死浓度(LC50)测定

区组设置。先用蒸馏水稀释病毒，确保病原溶液分散混匀，每个品种添食BmNPV病毒多角体1×105p/mL、1×106p/mL、1×107p/mL、1×108p/mL、1×109p/mL，共设5级浓度，先配兑高浓度病毒，然后依次逐级向低浓度稀释(取1份病毒，加蒸馏水9份)。每处理3个重复，共15区，每试验区定蚕100头。为保证数蚕时不伤蚕体，采用加网后连同蚕网数蚕的方法，将记好数的蚕连同蚕网用剪刀剪下备用。

添食时间。2龄起蚕饷食添毒，一次性添食完毕，之后饲喂正常桑叶，自然温湿度条件下饲养，正常眠起处理。

添食病毒。选择同品种、同叶龄、无虫眼、折叠的完好桑叶，用打孔机打成25 mm圆形桑叶。用200 uL移液枪吸取配好的NPV 0.3 mL均匀涂抹于6片桑叶背面(以6片桑叶为单位一字排开，每片0.05 mL)，涂抹过程中用塑料勺均匀展开在全叶面。涂抹病原按照由低浓度到高浓度的顺序进行。每次吸取病原液时摇动数次，确保病原浓度一致。涂抹桑叶稍微凉干后，每区喂6片桑叶，待添食病毒桑叶食完后，下次给桑改喂正常桑叶。

病蚕诊断。添食病毒后，每天早上8:30观察记录蚕的生长发育情况，发现病死蚕要及时挑出，以免交叉感染，并对病蚕进行检验。从感染后48 h开始，每天调查血液型脓病发病蚕数量，至4龄起蚕后调查结束[5-6]。血液型脓病病症判定方法：以血色呈乳白色，镜检有核型多角体为标准[7]。

2 结果分析

2.1 不同品种不同病毒浓度处理后病死蚕统计结果

根据以上试验方法，对每天的发病蚕进行镜检并记录，统计不同品种不同病毒浓度处理的发病蚕头数，其统计结果见表1。

表1 各品种不同病毒浓度处理的发病蚕统计结果

蚕品种NPV浓度(p/mL)供试蚕头数(头)发病数(头)发病率(%)限11×1091001001001×1081001001001×10710094941×10610069691×1051002828秋丰1×1091001001001×1081001001001×10710093931×10610076761×1051005656苍松1×1091001001001×1081001001001×1071001001001×10610089891×1051003636碧海1×1091001001001×1081001001001×1071001001001×10610084841×1051004949蜀绣1×1091001001001×1081001001001×1071001001001×10610080801×1051003434蜀水B1×1091001001001×1081001001001×1071001001001×10610091911×1051003636秋白1×1091001001001×1081001001001×10710095951×10610071711×1051004242

蚕品种NPV浓度(p/mL)供试蚕头数(头)发病数(头)发病率(%)75321×1091001001001×1081001001001×10710096961×10610074741×1051002828湘晖1×1091001001001×1081001001001×10710094941×10610068681×1051002020872A1×1091001001001×1081001001001×1071001001001×10610080801×1051003737皓月A1×1091001001001×1081001001001×10710099991×10610078781×1051004444限21×1091001001001×1081001001001×10710099991×10610075751×1051005050854B1×1091001001001×1081001001001×1071001001001×10610079791×1051003939日新1×1091001001001×1081001001001×1071001001001×10610097971×1051004848

蚕品种NPV浓度(p/mL)供试蚕头数(头)发病数(头)发病率(%)星月1×1091001001001×1081001001001×1071001001001×10610092921×1051003737渝春1×1091001001001×1081001001001×1071001001001×10610081811×1051004040872C1×10910042421×10810014141×107100441×106100111×10510000

从表1中可以看出：除871C、872C外，其它品种经口添食相同浓度的BmNPV，发病率均相对较高，特别是在添食1×108p/mL～1×109p/mL高浓度BmNPV条件下，发病率均接近100%。而871C、872C即使在添食1×109p/mL高浓度BmNPV条件下仍有50%左右未发病，对BmNPV抗性非常显著。

2.2 不同品种对BmNPV的抗性测定结果

根据表1统计得到的各品种感染BmNPV累计发病数，运用SPSS 13.0软件，计算各品种对BmNPV的抗性，以半数致死浓度(LC50)作为判断品种抗性强弱的指标。BmNPV对家蚕不同品种的毒力测定运算结果见表2。

表2 BmNPV对家蚕不同品种的毒力测定运算结果

从表2中可以看出：871C、872C对BmNPV的半致死浓度(LC50)达到109p/mL，相比较其它品种高出4～5个数量级，对BmNPV的抗性非常显著。其它品种之间相差不大，对NPV的半数致死浓度均分布在104～105p/mL范围内，其中菁松A、秋丰对NPV的半数致死浓度相比其它品种略低，分别为7.4×104p/mL、7.9×104p/mL，剩余品种对NPV的半数致死浓度均为105p/mL，对NPV抗性差异不明显。

3 结论与讨论

3.1 871C、872C对BmNPV的抗性显著高于其它参试品种，其它供试蚕品种之间对BmNPV的抵抗性差异不大

从试验结果中可以看出，871C、872C对BmNPV的半致死浓度(LC50)均达到109p/mL，而其它供试家蚕品种对BmNPV的半致死浓度(LC50)仅为104～105p/mL，两者相差4～5个数量级，抗性差异非常明显。其它供试的四川省主要蚕品种，除个别品种对BmNPV的半致死浓度(LC50)为104p/mL外，其余均为105p/mL，对BmNPV的抗性差异不明显。

3.2 本试验为四川抗BmNPV品种选育提供参考数据

通过本次试验，建立了成熟的家蚕品种抗BmNPV性能检测技术，为完善家蚕品种抗病鉴定体系奠定基础。同时掌握了四川部分主要家蚕品种对BmNPV抗性的第一手资料，填补了数据空白。同时，试验表明，选育适合四川气候特点的抗BmNPV家蚕新品种，如果仅限以四川现行推广品种资源为亲本几乎不可能，必须引进高抗BmNPV家蚕育种素材。

[1]吕鸿声.中国养蚕学[M].上海:上海科学技术出版社,1991:549-554.

[2]张远能,刘仕贤,霍用梅,等.若干家蚕品种对六种主要蚕病的抗性鉴定[J].蚕业科学,1982(2):94-97.

[3]荒武义信.家蚕不同品种抗NPV性能的差异[J].日本蚕丝学杂志,1973,42(4):279-294.

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[7]吕鸿声.昆虫病毒与昆虫病毒病[M].北京:科学出版社,1982:193.

Appraisal Study on the Resistance of Main PushBombyxmoriBreed to BmNPV

Yuan Guiyang1Cao Ningning1Wang Shaobai1Gong Dagang2Wen Tingyong1He Yanru1

(1SichuanProvinceNanchongSilkwormEggsFarm,NanchongSichuan637000,China;2SichuanProvinceLangzhongSilkwormEggsFarm,LangzhongSichuan637400,China; )

BmNPV is one of the most common and serious silkworm disease. Breeding of BmNPV-high resistance of the silkworm variety is the main research topic of current variety breeding. In order to grasp the difference between different silkworm varieties of BmNPV resistance and the difference of BmNPV-high resistance between varieties in domestic, we had tested the BmNPV resistance of current main silkworm varieties in Sichuan province like Chuanshan and Shushui through artificial mouth lick. The aim of this study was to investigate different resistance of silkworm varieties to BmNPV, and to screen breeding materials with high resistance to BmNPV, which laid the foundation of BmNPV high resistant varieties breeding. The test results showed that the resistance to BmNPV between different varieties was significant and 50% lethal concentration of 871c and 872c to BmNPV was 109p/ml. The differences between the other varieties of the resistance to BmNPV was not significant, and the median lethal concentration (LC50) ranged from 104to 105p/ mL.

Bombyxmoridiseases; Nuclear polyhedrosis virus; Resistance; 50% lethal concentration

袁桂阳(1964-)，男，高级农艺师，从事蚕桑生产工作。