液相色谱-质谱法检验人血浆中的沙丁胺醇

栾玉静，覃华开，王瑞花，董 颖，杜鸿雁

（1.公安部物证鉴定中心，北京 100038；2.柳州市公安局物证鉴定所，广西 柳州 545001）

液相色谱-质谱法检验人血浆中的沙丁胺醇

栾玉静1，覃华开2，王瑞花1，董 颖1，杜鸿雁1

（1.公安部物证鉴定中心，北京 100038；2.柳州市公安局物证鉴定所，广西 柳州 545001）

目的建立人血浆中沙丁胺醇的液相色谱-质谱联用（UPLC-MS/MS）检验方法。方法采用HSS T3色谱柱（2.1 mm×50 mm, 1.7 µm），流动相为甲醇-0.1 %甲酸水，梯度洗脱，流速为0.6 mL/min，采用UPLCMS/MS方法测定血浆中沙丁胺醇。结果人血浆中沙丁胺醇在1～1000 ng/mL范围内与峰面积比呈良好线性关系，最低检测限为0.1 ng/mL，方法回收率大于70 %，日内及日间精密度均小于10 %。结论经过多起案件的验证，所建立的方法简便、易于操作，且灵敏度高，能用于血浆中沙丁胺醇的检验。

液相色谱-质谱；人血浆；沙丁胺醇

沙丁胺醇（salbutamol）是一种选择性β2-肾上腺素能受体兴奋剂，对支气管平滑肌有特异性的扩张作用，临床上用于治疗支气管哮喘，具有抗炎、抗过敏及免疫作用。大剂量服用此药会产生中枢神经系统兴奋，被用作运动员的刺激剂。因而，国际奥委会对运动员尿液中的沙丁胺醇检出量作了规定。同时，该药由于与盐酸克伦特罗结构相似，且其在体内的半衰期较短，毒性作用较弱，因而逐步被用到养殖业以提高饲料转化率和瘦肉率。虽然很多国家包括我国已经将沙丁胺醇列为禁用品种，但是仍有很多不法商贩在饲料中添加沙丁胺醇。国内外均发生过因过量食用含沙丁胺醇的畜产品而导致的群体性中毒事件。中毒者会出现震颤、心悸等反应，还可能出现肌肉痉挛、过敏等症状，尤其对心脏和肝肾毒性较大。沙丁胺醇容易蓄积于眼角膜，尿液、血液、肝、肾、肺、肌肉中也容易残留。

目前，国内常见的检测方法包括酶联免疫法、荧光光度法[1]、电化学方法[2]、薄层色谱法、液相色谱法[3-5]和气相色谱法等。由于沙丁胺醇亲水性较强[6]，血浆药浓度低，因而需要建立灵敏度高的检测方法。液相色谱-质谱法具有灵敏度高、检出限低等特点，适用于人血中沙丁胺醇的检测。本研究建立了快速沉淀蛋白结合液相色谱-质谱测定人血浆中沙丁胺醇的方法，为沙丁胺醇在临床应用以及非法使用中的检验鉴定提供有效的方法。

1 仪器与试剂

Acquity 超高效液相色谱系统及化学工作站，Xevo TQ质谱检测器；沙丁胺醇标准品（中国药品生物制品检验所）；甲醇、乙腈、甲酸（色谱纯，Fisher）；去离子水（Millipore）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用ACQUITY UPLC®HSS T3色谱柱（2.1 mm× 50 mm，1.8 µm）（Waters）；流动相A：0.1 %甲酸水；流动相B：甲醇；流速：0.6 mL/min；梯度洗脱方式见表1所示；柱温30 ℃；进样体积2 µL。

表1 梯度洗脱条件Table 1 the conditions of gradient elution

2.2 质谱条件

电喷雾电离源（ESI），正离子扫描；离子源温度150 ℃；毛细管电压3.4 kV；雾化气温度500 ℃；雾化气流速1 000 L/h。扫描方式采用多反应监测方式（MRM）进行扫描，离子对为239.99/221.98、239.99/147.99和239.99/165.97。

2.3 溶液的配制

精密称取沙丁胺醇标准品10.0 mg于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至10 mL，制成浓度为1.0 mg/mL的标准储备液。溶液保存在4 ℃冰箱中。

2.4 样品处理方法

取空白人血浆0.5 mL，加入2 mL乙腈，混匀后振荡10 min，8 000 r/min离心20 min。取上清液过0.22 µm的滤膜后供LC-MS/MS分析。

2.5 线性关系考察

精密称取标准品储备液加入空白人血浆中使待测样品浓度分别为1、5、50、100、200、500、1000 ng/mL，分别进行测定。以峰面积（y）为纵坐标，以浓度（x，ng/mL）为横坐标作线性回归。回归方程为：y=312.21x-128.15；r2=0.9991。结果表明，沙丁胺醇在浓度为1～1000 ng/mL范围内峰面积与浓度呈线性相关，最低检测浓度为0.1 ng/mL。

2.6 回收率和精密度实验

取空白人血浆0.5 mL，加入一定量的沙丁胺醇，制备成沙丁胺醇浓度为5.0、50.0 、500.0 ng/mL的样品，利用相同的方法处理后供LC-MS/MS检验，结果三种浓度下沙丁胺醇的回收率分别为76.8 %、85.2 %和93.7 %，RSD分别为1.1 %、2.7 %和7.1 %。利用相同的方法进行测定，得到三种浓度的日内RSD分别为2.8 %、5.1 %和6.9 %，日间RSD分别为3.6 %、5.8 %和1.2 %。

2.7 稳定性实验

将上述制备样品分别于0、1、5、10、24 h进行测定，以沙丁胺醇峰面积进行计算，RSD为0.52 %。结果表明，样品在24 h内基本稳定。

3 讨论

3.1 沉淀剂的选择

沉淀蛋白是一种快速简单且成本较低的前处理方法，可以使用盐溶液、重金属、酸试剂及有机溶剂等作为沉淀剂，但是对于质谱检验而言，前三种会引入新的物质，影响质谱的检验。本实验中选择利用有机溶剂对水的亲和力来破坏蛋白质外的水键，使蛋白质在等电点使产生沉淀，从而达到净化生物检材的目的。本实验考察了乙腈和甲醇两种沉淀剂，结果表明用乙腈作为沉淀剂的回收率高于甲醇，且甲醇形成沉淀较为松散，为絮状型，易与上清液混合，从而降低了提取的回收率。乙腈形成的沉淀较为坚实，为块状型，附在试管底部。因而本研究选用乙腈作为沉淀剂，可以有效去除杂质，使响应灵敏，干扰变小。

3.2 色谱柱的选择

沙丁胺醇是一种极性较强的物质，使用反相色谱柱可能会导致保留较弱。本文考察了BEH C18、HSS T3、Shield RP18以及HILIC等多种色谱柱，实验结果表明，适用HSS T3柱色谱峰型较好，无拖尾现象，分离效果好。HSS T3色谱柱特别适用于反相色谱分离中增强对极性化合物和代谢物的保留。这个低配体密度C18色谱柱使分析物能更容易进入颗粒材料的孔结构中，为极性和疏水性分子提供均衡的保留性能而无需使用离子对试剂，适用于实验中沙丁胺醇的分离检验。

3.3 流动相的选择

反相作用色谱一般选用的有机溶剂为乙腈、甲醇和异丙醇，但在实验具体的操作温度下，异丙醇的粘度大，会使柱压过高，因此实验考察了甲醇和乙腈两种流动相。在水相中，缓冲盐的种类、浓度及水相的pH值都会影响待测物质的离子化效果，影响待测物质的保留时间和峰型，从而影响待测物质检测的灵敏度。

本实验考察了乙腈-水/甲醇、乙腈-水/甲酸胺、乙腈-水/甲酸/甲酸胺、甲醇-水/甲酸、甲醇-水/甲酸胺、甲醇-水/甲酸/甲酸胺体系作为流动相，缓冲盐甲酸胺浓度为5 mmoL/L，甲酸的浓度为0.1 %。实验结果表明，乙腈的分离度和稳定性不如甲醇，甲醇的峰型较好，灵敏度较高，因此选用甲醇作为最终的有机相。通过对比各流动相体系的峰型、出峰时间、分离度及稳定性，最终选择甲醇-水/ 0.1 %甲酸作为流动相。

3.4 质谱条件的优化

质谱条件是利用仪器的自动优化程序进行参数的自动优化，检测的离子源选择电喷雾电离源（ESI），在上述的色谱条件和质谱条件下，选择多反应离子检测模式（MRM），将标准品溶液进样分析，优化锥孔电压和碰撞能，选择三对信号强、干扰小的离子对作为定性离子对，在其中选择响应较高的作为定量离子对。

沙丁胺醇100 ng/mL的标准品溶液在2.2的实验条件下，采用多反应离子检测模式进样进行分析。分子式为C13H21NO3，分子量为239.31，在样品进入质谱后，仪器在给定的参数下改变碰撞能量，通过自动检测程序给出稳定的基峰离子m/z239.99，基峰离子作为母离子进入二级质谱产生三个子离子碎片m/ z221.98、m/z147.99和m/z165.97，选择其中丰度较高的m/z147.99子离子作为定量离子。

4 结论

本研究建立了利用乙腈直接提取的方法结合LC-MS/MS测定人血浆中沙丁胺醇的方法，该方法回收率高，重现性好，检测限低，且操作简单快速，适用于临床和相关案件中沙丁胺醇的定性定量检测。利用该方法实施了涉及沙丁胺醇非法使用案件中沙丁胺醇的检验鉴定，结果从受害者血浆中检出沙丁胺醇（图1）。

图1 血浆中沙丁胺醇的LC-MS/MS色谱图Fig 1 LC-MS/MS of salbutamol in plasma

［1］秦永平，邹远高，梁茂植，等. 反相高效液相色谱紫外检测法测定血浆中沙丁胺醇浓度［J］. 中国药学杂志，2000，35（7）：45-47.

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［6］ 国家药典委员会. 中华人民共和国药典(二部) ［Z］. 北京:化学工业出版社, 2005: 842-843.

Determination of Salbutamol in Human Plasma by Ultra Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry

LUAN Yujing1, QIN Huakai2, WANG Ruihua1, DONG Ying1, DU Hongyan1
(1.Institute of Forensic Science, Ministry of Public Security, Beijing, 100038, China 2. Institute of Forensic Science of Liu Zhou Municipal Public Security Bureau, Liuzhou, 545001, China)

ObjectiveTo develop a UPLC-MS/MS method for determining salbutamol in human plasma.MethodsThe separation of salbutamol was performed on a column of HSS T3（2.1 mm×50 mm，1.7 µm）. The mobile phase consisted of water solution containing 0.1 % formic acid and methanol. The fow rate was 0.6 mL/min with gradient elution. Salbutamol in human plasma was determined by UPLC-MS/MS.ResultsThe standard curve was linear over the range of 1-1000 ng/mL, and the lowest detectable limit was 0.1 ng/mL. The absolute recovery was more than 70 %. Both of the intra- and interday precision was within 10 % at three concentrations.ConclusionThe procedure was fully validated in terms of sensitivity, selectivity, precision and accuracy. The method developed was applied to the determination of salbutamol in human plasma samples collected from salbutamol-poisoning cases.

ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; human plasma; salbutamol

DF795.1

A

1008-3650(2016)06-0467-003

2016-06-30

格式：栾玉静，覃华开，王瑞花，等. 液相色谱-质谱法检验人血浆中的沙丁胺醇[J]. 刑事技术，2016,41(6): 467-469.

10.16467/j.1008-3650.2016.06.009

中央级公益性科研院所基本科研业务费专项基金计划项目（No:2013JB009）

栾玉静（1979—），女，山东龙口人，博士，副研究员，研究方向为毒物检验鉴定。E-mail:18836705@qq.com