BRCA2在卵巢癌中的表达及其与临床病理的相关性

王 莉，周 珂，孙华清，孟俊英

BRCA2在卵巢癌中的表达及其与临床病理的相关性

王 莉，周 珂，孙华清，孟俊英

目的 比较乳腺癌易感基因2（breast cancer suscepbility gene 2，BRCA2）在卵巢癌组织中的表达及其与临床病理因素的相关性，分析其作为早期卵巢癌诊断基因的可行性。方法采用荧光定量PCR的方法研究BRCA2 RNA在卵巢上皮癌、正常卵巢组织中的表达差异，并进一步应用western－blotting的方法检测BRCA2蛋白的表达。结果其BRCA2 RNA在卵巢癌组织中的表达量低于正常卵巢组织（P＜0．05）；BRCA2 RNA在临床Ⅲ～Ⅳ期的表达量低于临床Ⅰ～Ⅱ期（P＜0．05）。BRCA2 RNA与CA125在卵巢癌中的表达无相关性（P＜0．05）。BRCA2蛋白在卵巢癌中的表达量同样低于正常卵巢组织（P＜0．05）。结论BRCA2在卵巢癌的发生发展中起着一定作用，其与CA125的联合监测有望提高卵巢癌的阳性诊断率。

卵巢癌；BRCA2；基因表达；蛋白表达

卵巢癌是妇科最常见恶性肿瘤，其发病率仅次于宫颈癌和子宫内膜癌，具有早期症状隐匿、预后差、死亡率高的特点［1］。由于缺乏敏感及特异性较高的早期筛查手段，一旦发现大多为中晚期。因此，早期诊断是提高卵巢癌患者5年生存率的关键。然而卵巢癌早期诊断方法较少，灵敏度及特异性不高，因此寻找有效的血清标志物对卵巢癌早期诊断及预后有着极其重要的意义。

乳腺癌易感基因 2（breast cancer susceptibility gene 2，BRCA2）是迄今发现的与乳腺癌发生有关的易感基因，在调节人体细胞的复制、遗传物质DNA损伤修复、细胞的正常生长方面有重要作用。它的异常表达与乳腺癌早期发生、发展和转移密切相关［2］。目前该基因在卵巢癌发生发展中的作用也受到日益关注。本研究应用荧光定量PCR、Western blot技术监测BRCA2在卵巢癌患者中的表达并进一步分析其临床意义。

1 资料与方法

1．1 标本采集收集笔者所在医院2012年1月—2013年12月手术切除的卵巢上皮癌标本共35例（患者年龄35～74岁），其中浆液性囊腺癌18例、黏液性囊腺癌13例，子宫内膜癌2例，透明细胞癌2例。另取23例正常卵巢组织作为对照，患者术前均未行化疗，每例卵巢癌患者术前抽取静脉血采用电化学发光法检测CA125。

1．2 方法

1．2．1 卵巢组织细胞中总RNA提取、反转cDNA使用QIAGEN RNA提取试剂盒，按照说明书提取组织细胞中的总RNA。简略如下：Trizol溶解样本溶浆液，4℃离心，上清加入等体积异丙醇，离心，乙醇沉淀，DEPC水溶解。使用随机引物、反转录酶采用常规RT－PCR方法，将总RNA反转成cDNA，－80℃保存备用。

1．2．2 荧光定量PCR检测卵巢组织细胞中BRCA2表达 PCR反应体系：10×缓冲液 2．5 μl，Mg2+（25mMol）1．5 μl，dNTP（各10mMol）0．75 μl，DNA聚合酶0．25 μl，ROX（250×）0．1 μl，上游引物0．5 μl，下游引物0．5 μl，探针0．3 μl，ddH2O 0．3 μl，ddH2O 14．6。分别对应加入21 μl PCR反应液于96孔PCR反应板中，每个孔待测样本的cDNA加4 μl。放入荧光定量PCR仪器中测定。反应条件：48℃反应30 min，然后94℃保温5 min，再按94℃20 s→60℃30 s循环40次。

1．2．3 Western blot检测BRCA2蛋白表达 组织置于冰上研磨碾碎，每100 mg加入0．2 ml细胞裂解液，冰上充分裂解30 min，12000 r／min离心收集上清，将蛋白于6%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。分离后将蛋白转移至硝酸纤维素膜37℃封闭1 h。兔抗人BRCA2（一抗稀释度1∶1 000）β－actin（一抗稀释度1∶500）4℃孵育过夜，漂洗，加二抗1∶2000 37℃孵育1 h滴加发光试剂暗室曝光显示条带。

1．3 统计学方法应用SPSS11．5统计软件包进行分析，统计学方法采用t检验、Pearson相关性检验。P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 荧光定量PCR检测BRCA2表达将收集到的35例卵巢癌组织和23例正常卵巢组织的cDNA按照标准操作程序进行荧光定量PCR检测，每个标本设3个复孔，每个标本分别进行BRCA2和βactin表达量的检测。三复孔每个指标取平均值，分别计算BRCA2与β－actin表达量的比值，计算中位数和标准差，并进行统计学分析。结果显示BRCA2 RNA在卵巢癌组织中的表达量为0．81±0．12，而正常卵巢组织中的表达量为2．62±1．86，BRCA2在卵巢癌组织中的表达量显著低于正常卵巢组织 （P＜0．01）。

2．2 Western blot检测结果从35例卵巢癌标本中选择10例，正常卵巢组织选择8例，进行BRCA2蛋白水平表达差异的检测。将该18例标本进行组织匀浆，使用BRC蛋白定量试剂盒将各标本蛋白总量调整统一，使用抗BRCA2和抗β－actin进行Western blot检测。在分子量384KD处可见BRCA2和43kD处可见β－actin特异性蛋白条带。图像灰度分析后，将BRCA2蛋白条带与β－actin蛋白条带进行比值计算，显示BRCA2卵巢癌为0．52±0．21，正常卵巢组织中为1．62±0．11。说明BRCA2蛋白在卵巢上皮癌中的表达显著低于正常卵巢组织（P＜0．01）。

图1 BRCA2在卵巢癌和正常卵巢组织中的电泳结果

2．3 BRCA2 RNA表达与卵巢癌临床病理因素的关系BRCA2 RNA表达在不同年龄、病理类型（因子宫内膜癌及透明细胞癌病例数少，未纳入比较）、肿瘤分化程度和临床分期间差异结果见表1，BRCA2蛋白表达在临床Ⅲ～Ⅳ期的表达率低于临床Ⅰ～Ⅱ期（P＜0．05）。

2.4 BRCA2 RNA与CA125的相关性分析Pearson相关分析显示，BRCA2 RNA与CA125在卵巢癌中的表达没有关联性（P＞0．05）。

3 讨论

表1 BRCA2在不同临床病例特征卵巢癌中表达量的统计分析

由于卵巢癌早期多无明显症状，并且卵巢又位于盆腔的深部，平时较难扪及，因此卵巢癌一旦发现均为中晚期，是女性癌症死亡的主要原因。血清癌胚抗原125（CA125）是筛查卵巢癌指标之一，但是其敏感度及特异度不高［3］。基于上述原因，进一步寻找卵巢癌新的肿瘤标志物以便于对卵巢癌做出早期诊断及治疗成为研究的热点。

有研究发现BRCA2基因定位于13q12－13的一组与乳腺癌发生、发展及预后有重要关系的抑癌基因。基因组DNA长约70 kb，编码区10987 kb，共27个外显子，第11外显子是最大的外显子，是DNA修复相关蛋白51（DNA damage repair protein 51，RAD51）结合的位点。BRCA2的mRNA长约10 kb，编码抑制肿瘤的BRCA2蛋白，该蛋白由3418个氨基酸残基组成［4］。BRCA1／2作为肿瘤抑制基因，在维护染色体结构和数目稳定方面具有重要作用。当基因突变发生后，通过改变其蛋白质结构促使染色体不稳定而失活，进而促进肿瘤的发生和发展［5－7］。

该研究结果表明，BRCA2 RNA在卵巢癌组织中的表达下调，由此推测BRCA2基因可能与卵巢癌的发生密切相关，该基因在卵巢癌中同样发挥着抑癌基因的作用。同时BRCA2在晚期卵巢癌中的表达低于早期，推测该基因不但有望作为早期卵巢癌的检测基因，并且可能参与了卵巢癌的病程进展。CA125是目前应用较为广泛的卵巢上皮癌的肿瘤标志物，但是其敏感度及特异度偏低，并且多在晚期卵巢癌中升高，因此为了提高卵巢癌的早期诊断率，目前认为将2～3个较为敏感的肿瘤标志物同时用于诊断以提高卵巢癌的早期诊断率。该研究显示，BRCA2 RNA与CA125在卵巢癌中的表达没有相关性，因此两者的联合诊断可能会提高卵巢癌的诊断率。

该研究结果同时显示，BRCA2蛋白在卵巢癌组织中的表达低于正常卵巢组织，同基因的表达结果相一致。BRCA2蛋白不仅有可能作为卵巢癌的肿瘤标志物，用于卵巢癌的诊断，而且有可能作为卵巢癌免疫治疗的靶目标，在卵巢癌的治疗中发挥作用。

［1］Lamy PJ，Roques S，Viglianti C，et al．HE4，a novel marker for epithelial ovarian cancer：evaluation of analytical performances［J］．Ann Biol Clin（Paris），2010（68）：325-329．

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［3］于晨洁，金爱红，周霞平．联合检测肿瘤标志物CA125、OPN、hK6和hK10对卵巢癌早期诊断的意义［J］．深圳中西医结合杂志，2015，25（11）：56－58．

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［6］De Siervi A，De Luca P，Byun JS，et al．Transcriptional autoregulation by BRCA1［J］．Cancer Res，2010，70（2）：532－542．

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［2015-10-20收稿，2015-11-19修回］

［本文编辑：吴 蓉］

Expression of breast cancer suscepbility gene 2 in ovarian carcinoma tissue and its clinicopathological significance

WANG Li，ZHOU Ke，SUN Hua-qing，et al.
Dept.of Gynecology and Obstetrics，No.153 Hospital of Chinese PLA，Zhengzhou，Henan 450042，China

Objective To study the expression of breast cancer suscepbility gene 2（BRCA2）in ovarian carcinoma and its clinicopathological significance，to analyse the feasibility of BRCA2 as a diagnostic gene of early ovarian carcinoma．MethodsThe expression of BRCA2 RNA in ovarian epithelial carcinoma and normal tissues was detected by PCR，then the expression of BRCA2 protein in those tissues was detected by western－blotting．Results The expression level of BRCA2 RNA in ovarian carcinoma was lower than that in normal ovarian tissues（P＜0．05）．The expression level of BRCA2 RNA in stageⅢ－Ⅳ was lower than stageⅠ－Ⅱ （P＜0．05）．There was no correlation between BRCA2 and CA125 values（P＜0．05）．The expression of BRCA2 protein in ovarian carcinoma was also lower than that in normal ovarian tissues（P＜0．05）．ConclusionBRCA2 might play an important role in ovarian occurrence and development．The simultaneous determination of BRCA2 and CA125 may increase the sensitivity for diagnosis of ovarian carcinoma．

Ovarian carcinoma；Breast cancer suscepbility gene2（BRCA2）；Gene expression；Protein expression

R737.31：R730.43

A

10.14172/j.issn1671-4008.2016.04.007

450042河南郑州，解放军153医院妇产科（王莉，周珂，孙华清，孟俊英）