白念珠菌定植和肠源性感染模型研究进展

朱芳 何丽娟 黄鑫 安毛毛 姜远英,

(1.同济大学附属第十人民医院，上海 200072；2.第二军医大学药学院，上海 200433)



·综述·

白念珠菌定植和肠源性感染模型研究进展

朱芳1何丽娟2黄鑫1安毛毛1姜远英1,2

(1.同济大学附属第十人民医院，上海 200072；2.第二军医大学药学院，上海 200433)

肠道共生白念珠菌是人体感染白念珠菌的重要来源。白念珠菌口胃接种到药物处理的成年小鼠，造成白念珠菌胃肠道定植和肠源性感染。此模型可以更加贴切地模拟白念珠菌人体胃肠道大量定植和肠源性感染。该文总结2000年以来白念珠菌定植和感染成年小鼠相关国内外文献，对白念珠菌胃肠道定植和肠源性感染模型新进展作一综述。

白念珠菌；定植；侵袭性感染

[Chin J Mycol，2016，11(2):125-128]

白念珠菌为条件致病菌，定植于30%～70%健康人的皮肤，生殖道黏膜和胃肠道黏膜[1]。随着临床侵袭性治疗手段的发展和广谱抗生素、肾上腺皮质激素、免疫抑制剂等长期大量应用，白念珠菌可趁机大量繁殖，战胜人体固有免疫防线，侵袭入口腔、胃肠道及阴道黏膜，进而播散至血液或其他组织器官中，造成侵袭性感染。人体肠道定植白念珠菌被认为肠源性念珠菌感染的重要途径[2]。研究者对念珠菌定植和感染成年小鼠模型做了大量研究,主要归类为白念珠菌胃肠道定植、食管胃肠道感染和肠源性系统感染。现主要就2000年以来成年小鼠胃肠道定植和感染白念珠菌模型国内外相关研究成果进行总结，以期为白念珠菌动物感染试验提供参考。

1 白念珠菌胃肠道定植小鼠模型

小鼠肠道内共生大量菌群。它们相互制约，维持肠道微生态平衡。白念珠菌非小鼠内源性真菌[3]。以粪便载菌量考察白念珠菌胃肠道定植，发现定植很快消失[4-7]。Yordanov M等[4]给小鼠口胃接种白念珠菌后，第5天检测小鼠粪便载菌量<2×102CFU/g。研究者使用抗菌药物打破肠道菌群平衡，发现白念珠菌定植 (以研究时间计，定植多为2～3周，较长时间为80 d以上)[5-11]。Sarah等[5]给予小鼠饮用含抗菌药物 (四环素1 mg/mL、链霉素2 mg/mL和庆大霉素0.1 mg/mL)的溶液，4 d后灌胃给予白念珠菌，试验全程给予抗菌药物溶液。如接种白念珠菌DAY185，5×107CFU/只，第21天时，发现鼠便载菌量为4～5 log10 CFU/g。给予胃肠道黏膜异常小鼠抗菌药物治疗并口胃接种白念珠菌，亦造成小鼠白念珠菌定植。Takahashi等[12]先予小鼠蛋白营养不良饮食，造成小鼠消化道道黏膜异常 (如小肠绒毛短，直肠上皮细胞层变短、薄、无规律，食管角蛋白层变薄等)。灌胃给菌 (1.5×108CFU/只)后，小鼠饮用含链霉素溶液 (0.25 mg/mL)至试验结束。第7天蛋白营养不良组小鼠便载菌量是蛋白营养丰富组量的10倍左右。蛋白营养不良性小鼠白念珠菌接种后3个月，小鼠便载菌量6～7 log10 CFU/g，营养丰富的小鼠第35天检测不到小鼠便菌量。

2 白念珠菌食管胃肠道感染小鼠模型

SCID小鼠为免疫缺陷小鼠，24 h自由饮用含白念珠菌的混悬液 (5×107CFU/mL)，可以模拟AIDS患者出现的黏膜念珠菌病 (黏膜出现严重念珠菌感染，很少发生系统性感染)[13-14]。同样，口胃接种白念珠菌，IL-12基因敲除小鼠易发生口腔白念珠菌感染，未发生系统性感染[15]。自然杀伤细胞和T细胞缺陷无菌小鼠 (Tgε26)自由饮用含白念珠菌的混悬液 (106CFU/mL)后的3～5周内，小鼠口腔食管和胃感染使小鼠致死，但不引起系统性念珠菌感染[16-17]。无菌小鼠C57BL/6和BALB/c，易感胃部真菌病；口胃接种白念珠菌后，白念珠菌能够快速定植 (口腔接种1 d后)和慢性定植 (研究期为4周)，未见内部脏器侵袭性感染[18]。

3 白念珠菌肠源性系统感染小鼠模型

研究显示用抗菌药物联合口胃接种白念珠菌处理小鼠，不仅导致白念珠菌的胃肠道定植，还可致白念珠菌向内脏侵袭[4,19]。Yordanov M等[4]给予小鼠饮用含阿莫西林 (1 mg/mL)和阿米卡星 (0.1 mg/mL)溶液7 d后，灌胃给予白念珠菌 (1×108CFU/只)，于第15天检测出肾脏载菌量 (4.3±0.8 log10 CFU/g)。

大剂量使用免疫抑制剂，可导致免疫低下和胃肠道黏膜的破坏，白念珠菌和细菌 (如革兰阴性菌)等可乘机穿过破损的黏膜，造成感染。抗菌药物的应用不仅减少了内源性菌群，同时可以一定程度上避免小鼠死亡于细菌感染[19-20]。免疫抑制剂联合非全程抗菌药物治疗，接种后的短暂时间内可以检测到脏器白念珠菌侵袭和长时间的定植[21]。全程给予免疫抑制剂和抗菌药物治疗的动物接种白念珠菌，可以导致白念珠菌播散性感染[11,19]。Karl V Clemons等[19]发现提前3 d给予5-氟尿嘧啶 (200 mg/kg)、庆大霉素 (0.2 mg/mL)、克林霉素 (1 mg/mL)和万古霉素 (1 mg/mL)；皮下给予亚胺培南西司他丁5 mg，第4天小鼠饮用含白念珠菌的混悬液 (5×107CFU/mL)感染 (记为第0天)后，以后每7 d免疫抑制1次，继续抗菌药物治疗，并将亚胺培南西司他丁改为腹腔注射。5～15 d全部小鼠肝脏检测出白念珠菌，肾脏较少感染。数据显示，免疫抑制同时添加抗菌药物小鼠组织载菌量较未给抗菌药物高。

免疫抑制联合胃肠道黏膜异常，可模拟白念珠菌血液播散。Takahashi等[12]研究发现蛋白营养不良饮食造成小鼠肠道黏膜异常，合并抗菌药物处理，可以导致白念珠菌的长期定植；在定植的基础上，感染后第4天开始腹腔注射给予甲氨蝶呤 (150 mg/kg)和环磷酰胺 (150 mg/kg)，以后4 d每天腹腔注射环磷酰胺 (150 mg/kg)，可以造成小鼠白念珠菌血液播散病。在第7～8天肝脏首先检测出白念珠菌，之后在血液中检测到白念珠菌。

在白念珠菌小鼠肠源性感染的模型中，研究者多采用免疫抑制与抗菌药物等的联合应用[11-12,19-22]。Andrew等[20]在探究构成白念珠菌播散性感染相关条件时，构建了白念珠菌定植和感染模型。具体如下：连续3 d小鼠饮用含链霉素 (2 mg/mL)、青霉素G (1 500 U G/mL)和氟康唑 (0.25 mg/mL)溶液，第4天饮用除氟康唑外的上述溶液，第5天起连续5 d饮用含白念珠菌 (1×107CFU/mL)和链霉素、青霉素混悬液。接着给予免疫抑制剂 (如环磷酰胺每隔1 d腹腔注射150 mg/kg，共3次等免疫方案)，此时另加庆大霉素 (0.2 mg/mL)，并继续给予链霉素和青霉素G。最近研究者[7-12,23]调整了Andrew等的白念珠菌定植和感染模型，进行相关研究。如Simon Vautier等[7]在探究Dectin-1在白念珠菌胃肠道定植的作用时，不再给予免疫抑制剂；将青霉素由1 500 U/mL调至2 000 U/mL，其他试剂配置剂量不变，抗菌药物给药途径、过程不变。

4 模型的评估

在评估模型时，要把握“定植”“感染”的特点。白念珠菌共生机体内，携带者无症状[15]。在小鼠白念珠菌定植模型中，一般小鼠无死亡；观察期间有较大量的鼠便载菌量和肠道组织载菌量[7-12]；有低量的肾载菌量[7,9]。在食管胃肠道感染模型中，小鼠肝脏、肾脏和脾脏无念珠菌感染，黏膜念珠菌侵袭，病理检查发现胃肠道组织内存在菌丝等[15-16]。在肠源性播散性感染的模型中，小鼠可出现死亡或垂死 (昏睡，眩晕，体重下降和鼠毛干燥褶皱)；肝首先出现较高的载菌[12,24]，伴随较高的肠道载菌量或者在检查的脏器中 (肠、肾脏、肝脏和脾脏)至少有3个脏器以上有较高的载菌量 (>1.5 log10 CFU/g)[11]。

5 讨 论

机械屏障、微生物屏障、免疫屏障和化学屏障共同组成机体黏膜屏障[25]，在防御病原侵袭中发挥着重要的作用。研究认为肠道黏膜损伤、肠道菌群失衡和宿主免疫防护缺陷等三因素促进白念珠菌感染[26]。Yamaguchi N等[27]以营养丰富的纯化饲料 ( AIN-93G)饲养小鼠，单次口胃接种白念珠菌导致小鼠胃部念珠菌病。研究显示其胃部有机酸浓度和乳酸杆菌数量较商用饲料低，认为乳酸杆菌产生的有机酸对白念珠菌的抑制作用影响了它胃肠道定植。另外，研究发现胆汁能显著降低白念珠菌对抗真菌药物的敏感性等[28-29]。可见，化学屏障 (胃酸、胆汁、各种消化酶等等)在后期的研究中应该得到重视。

在免疫正常时，小鼠口胃接种白念珠菌，少量白念珠菌进入肝脏，可能是白念通过门静脉循环或者胆道进入[20]。在肠源性念珠菌感染模型中，肝脏感染很常见[19-20]。白念珠菌主要定植在胃黏膜的贲门附近[12,21,27,30]。研究发现胃部载菌量高，上部小肠菌量最低，而顺着肠道向下，菌量递增[3]。盲肠内容物中可见酵母态和菌丝态白念珠菌[3-4]。

白念珠菌同一菌株在不同品系小鼠定植能力不同[7,26]，表达不同的细胞因子[18]，如无菌动物C57BL/6和BALB/c小鼠胃部感染念珠病，表达不同量趋化因子、细胞因子和β-防护素。不同的白念珠菌菌株黏膜定植能力不同，播散能力也不同。白念珠菌定植时根据机体不同微环境表达不同的基因，进行自我调节[5]。很多研究者选用SC5314为工具菌进行体内研究，SC5314不能很好地定植黏膜表面[31]。为避免菌株自身的局限性，研究提示最好使用多株白念珠菌，应包括临床分离菌株[23,25]。研究提示应关注实验操作等：抗菌药物处理的小鼠易感宿主 (小鼠)-宿主 (小鼠)的真菌传播[8]，其媒介可能是操作用手套，小鼠定位器和换笼时的粪便污染等等。

6 展 望

尽管与尾静脉注射白念珠菌混悬液模拟播散性感染模型相比，本模型需要控制条件更多，实验周期更长；但它更接近临床发病过程，更能启发新思路。最近研究[23]以成年小鼠可以抵抗白念珠菌的定植为启发点，发现共生厌氧菌在抵制白念珠菌定植中起到重要作用，如多形拟杆菌激活HIF-1α (激活先天免疫反应的重要因子)和LL-37 (抗微生物肽)，调节直肠免疫反应，从而抑制白念珠菌的定植。研究者认为通过影响肠道黏膜免疫因素，调节白念珠菌的定植，从而为预防念珠菌侵袭性感染找到新的策略。另外，在探讨主要宿主免疫反应、研究基因修饰菌株毒力因子、评价 (药物或疫苗)药效和白念珠菌感染的诊断方法等也发挥重要作用，而两种不同给菌方式复制的感染模型的结合，进一步发挥它们积极的作用。

[1] Perlroth J,Choi B,Spellberg B.Nosocomial fungal infections:epidemiology,diagnosis,and treatment[J].Med Mycol,2007,45(4):321-346.

[2] Nucci M,Anaissie E.Revisiting the source of candidemia:skin or gut[J]?Clin Infect Dis,2001,15;33(12):1959-1967.

[3] Wiesner SM1,Jechorek RP,Garni RM,et al.Gastrointestional colonization byCandidaalbicansmutant strains in antibiotic-treated mice[J].Clin Diagn Lab Immunol,2001,8(1):192-195.

[4] Yordanov M,Dimitrova P,Patkar S,et al.Ibogaine reduces organ colonization in murine systemic and gastrointestinalCandidaalbicansinfections[J].J Med Microbiol,2005,54,647-653.

[5] White SJ,Rosenbach A,Lephart P,et al.Self-regulation ofCandidaalbicanspopulation size during GI colonization[J].PLoS Pathog,2007,3(12):e184.

[6] Maraki S,Lionakis S,Ntaoukakis M,et al.Effects of levofloxacin,moxifloxacin and prulifloxacin on murine gut colonization byCandidaal-bicans[J].Med Mycol,2011,49(4):419-423.

[7] Vautier S,Drummond RA,Redelinghuys P,et al.Dectin-1 is not required for controllingCandidaalbicanscolonization of the gastrointestinal tract[J].Infect Immun,2012,80(12):4216-4222.

[8] Cutler JE,Corti M,Lambert P,et al.Horizontal transmission ofCandidaalbicansand evidence of a vaccine response in mice colonized with the fungus[J].PLoS One,2011,6(7):e22030.

[9] Vautier S,Drummond RA,Chen K,et al.Candidaalbicanscolonization and dissemination from the murine gastrointestinal tract:the influence of morphology and Th17 immunity[J].Cell Microbiol,2015,17(4):445-450.

[10] Wenji Song,Huafeng Wang,Jiangye Chen.CandidaalbicansSfl2,a temperature-induced transcriptional regulator,is required for virulence in a murine gastrointestinal infection model[J].FEMS Yeast Res,2011,11(2):209-222.

[11] Mellado E,Cuenca-Estrella M,Regadera J,et al.Sustained gastrointestinal colonization and systemic dissemination byCandidaalbicans,Candidatropicalis andCandidaparapsilosis in adult mice[J].Diagn Microbiol Infect Dis,2000,38(1):21-28.

[12] Takahashi K,Kita E,Konishi M,et al.Translocation model ofCandidaalbicansin DBA-2/J mice with protein calorie malnutrition mimics hematogenous candidasis in humans[J].Microb Pathog,2003,35(5):179-187.

[13] Clemons KV,Stevens DA.Treatment of orogastrointestinal candidosis in SCID mice with fluconazole alone or in combination with recombinant granulocyte colony-stimulating factor or interferon-gamma[J].Med Mycol,2000,38(3):213-219.

[14] Clemons KV,Stevens DA.Efficacy of ravuconazole in treatment of mucosal candidosis in SCID mice[J].Antimicrob Agents Chemother,2001,45(12):3433-3436.

[15] Ashman RB,Vijayan D,Wells CA.IL-12 and related cytokines:function and regulatory implications inCandidaalbicansinfection[J].Clin Dev Immunol,2011，2011:686597.

[16] Westwater C,Schofield DA,Nicholas PJ,et al.Candidaglabrata andCandidaalbicans;dissimilar tissue tropism and infectivity in a gnotobiotic model of mucosal candidiasis[J].FEMS Immunol Med Microbiol,2007,51(1):134-139.

[17] Westwater C,Balish E,Warner TF,et al.Susceptibility of gnotobiotic transgenic mice (Tgepsilon26) with combined deficiencies in natural killer cells and T cells to wild-type and hyphal signalling-defective mutants ofCandidaalbicans[J].J Med Microbiol,2007,56(Pt 9):1138-1144.

[18] Schofield DA,Westwater C,Balish E.Divergent chemokine,cytokine and beta-defensin responses to gastric candidiasis in immunocompetent C57BL/6and BALB/c mice[J].J Med Microbiol,2005,54(Pt 1):87-92.

[19] Clemons KV,Gonzalez GM,Singh G,et al.Development of an orogastrointestinal mucosal model of candidiasis with dissemination to visceral organs[J].Antimicrob Agents Chemother,2006,50(8):2650-2657.

[20] Koh AY,Köhler JR,Coggshall KT,et al.Mucosal damage and neutropenia are required forCandidaalbicansdissemination[J].PLoS Pathog.2008,8;4(2):e35.

[21] Kretschmar M,Felk A,Staib P,et al.Individual acid aspartic proteinases (Saps) 1-6 ofCandidaalbicansare not essential for invasion and colonization of the gastrointestinal tract in mice[J].Microb Pathog,2002,32(2):61-70.

[22] Nichterlein T,Buchheidt D,Hein A Comparison of glucan detection and galactomannan enzyme immunoassay in gastrointestinal and systemic murine candidiasis.Diagn Microbiol Infect Dis,2003,46(2):103-108.

[23] Fan D,Coughlin LA,Neubauer MM,et al.Activation of HIF-1α and LL-37 by commensal bacteria inhibitsCandidaalbicanscolonization[J].Nat Med,2015,21(7):808-814.

[24] Uno K,Sugiura S,Konishi M,et al.Evaluation of diagnostic methods forCandidaalbicanstranslocation in a mouse model:seminested polymerase chain reaction,blood culture,and serological assays[J].J Infect Chemother,2007,13(4):196-203.

[25] Lei Yan,Chunhui Yang,jianguo Tang.Discruption of the intestinal mucosal barrier inCandidaalbicansinfections[J].Microbiological Reseach,2013,168(7):389-395.

[26] Andrew Y.Koh.Murine model ofCandidagastrointestinal colonization and dissemination[J].Eukaryot Cell,2013,12(11):1416-1422.

[27] Yamaguchi N,Sonoyama K,Kikuchi H,et al.Gastric colonization ofCandidaalbicansdiffers in mice fed commercial and purified diets[J].J Nutr,2005,135(1):109-115.

[28] Nagi M,Tanabe K,Takano Y,et al.Serum or bile affects theinvitroazole susceptibilities ofCandidaspp[J].Jpn J Infect Dis,2009,62(4):306-308.

[29] Jacobsen ID,Lüttich A,Kurzai O,et al.Invivoimaging of disseminated murineCandidaalbicansinfection reveals unexpected host sites of fungalpersistence during antifungal therapy[J].J Antimicrob Chemother,2014,69(10):2785-2796.

[30] Conti HR,Huppler AR,Whibley N,et al.Animal models for candidasis[J].Curr Protoc Immunol,2014,(105)105:19.6.1-19.6.17.

[31] Rahman D,Mistry M,Thavaraj S,et al.Murine model of concurrent oral and vaginalCandidaalbicanscolonization to study epithelial host-pathogen interactions[J].Microbes Infect,2007,9(5):615-622.

[本文编辑] 卫凤莲

The research progress onCandidaalbicanscolonization and infection in the mice gastrointestinal tract

ZHU Fang1,HE Li-juan2,HUANG Xin1,AN Mao-mao1,JIANG Yuan-ying1,2

(1.ShanghaiTenthPeople’sHospital,TongjiUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200072,China;2SchoolofPharmacy,TheSecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China)

Candidaalbicanswas regarded as a commensal within the gut in humans and the gut had been considered as an important site forCandidaalbicansinvasive infection.Antibiotic(s)-treated mice orally givenCandidaalbicanscould closely mimic the clinical manifestations,including gastrointestinal colonization and invasive infection.Immunosuppressants were required for the worse invasive infection.There we summarized the progress on the models ofCandidaalbicanscolonization and/or invasive infection in the gastrointestinal tract from related literatures since 2000.

Candidaalbicans;colonization;invasive infection

国家自然科学基金 (81330083)，科技部新药创制重大专项 (2012ZX09103101-003)

朱芳，女 (汉族)，硕士研究生在读.E-mail:fzhu2013@163.com

姜远英，E-mail:jiangyy@tongji.edu.cn;安毛毛，E-mail:anmaomao@tongji.edu.cn

R 519.3

A

1673-3827(2016)11-0125-04

2015-07-24