大肠癌肝转移患者血清中相关癌基因甲基化水平的检测

齐 翀, 郝 总， 洪 亮， 殷庆章

复旦大学附属上海市第五人民医院普通外科，上海 200240

短篇论著

大肠癌肝转移患者血清中相关癌基因甲基化水平的检测

齐 翀, 郝 总， 洪 亮， 殷庆章*

复旦大学附属上海市第五人民医院普通外科，上海 200240

目的：探讨大肠癌肝转移患者血清相关癌基因甲基化水平的变化。方法：选择2011年9月—2013年12月因原发性大肠癌入院伴或不伴肝转移患者各32例，分别作为试验组A和试验组B。所有患者在入院之前均未进行化疗或放疗。另选择20例健康体检者作为对照组。提取研究对象血清中DNA，采用甲基化特异性PCR法检测E-cad、ID4、ESR1、APC或HACE基因甲基化异常。结果：试验组A检测出19例E-cad、ID4、ESR1、APC或HACE甲基化异常；试验组B检测出10例E-cad、ID4、ESR1、APC或HACE甲基化异常；对照组未检测出E-cad、ID4、ESR1、APC或HACE甲基化异常。3组间差异有统计学意义(P<0.01)。结论：血清E-cad、ID4、ESR1、APC和HACE基因甲基化状态联合检测有利于大肠癌肝转移的临床诊治。

大肠癌；肝转移；甲基化；癌基因

在中国，大肠癌的发病率及死亡率逐年增高。35%～55%的大肠癌患者会发生肝转移，约25%的患者在诊断时已出现肝转移[1]。肝转移是造成大肠癌患者死亡的主要原因之一。目前，临床常用的大肠癌血清学标志物包括基因和蛋白，但是大多数标志物的特异性和(或)敏感性不理想。近年来发现，肿瘤患者血清中存在DNA质或量改变。在此基础上发现的肿瘤标志物有良好的临床应用前景。已有文献[2-7]报道，E-cad、ID4、ESR1、APC和HACE基因的异常甲基化状态与大肠癌的发生、发展及转移相关，可用来预测大肠肿瘤的复发。本研究进一步分析了大肠癌伴或不伴有肝转移患者的E-cad、ID4、ESR1、APC和HACE基因的甲基化情况，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 我院于2011年9月—2013年12月确诊原发性大肠癌伴或不伴有肝转移患者各32例，分别作为试验组A和试验组B。所有患者在入院前均未进行化疗或放疗。试验组A 32例患者中，男性13例，女性患者19例；年龄23～78岁，平均(56.5±7.9)岁；Ducks A期11例，B期8例，C期8例，D期5例。试验组B 32例患者中，男性16例，女性16例；年龄24～79岁，平均(55.5±9.9)岁；Ducks A期12例，B期9例，C期6例，D期5例。另外选择20例健康体检者作为对照组，其中男性12例，女性8例；年龄22～75岁，平均(54.5±7.8)岁。3组患者的一般资料差异无统计学意义，具有可比性。本研究通过医院医学伦理委员会审核，所有患者知情者同意并签署知情同意书。

1.2 方 法

1.2.1 3组研究对象的血清收集及DNA提取 术前采集健康体检者和患者全血2 mL，3 000 ×g离心，收集约1 mL血清，-80℃冰箱保存。采用QIAamp DNA Mini Kit试剂盒(德国Qiagen公司)，从200 μL血清标本中提取基因组DNA。

1.2.2 DNA甲基化修饰和甲基化特异性PCR 基因组DNA的亚硫酸盐修饰 吸取约1 μg 的DNA样品，用3 mol/L NaOH进行变性反应，再行NaHSO3修饰，50℃水浴避光过夜。此时，胞嘧啶可转变为尿嘧啶或发生甲基化。修饰后的DNA通过乙醇沉淀与PCR级去离子水形成悬浮液，再进行甲基化特异性PCR。甲基化特异性PCR反应体积为25 μL，包括修饰DNA 2 μL、1×PCR buffer Ⅱ (美国Perkin Elmer公司 )、2 mmol/L MgCl2、0.25 mmol/L dNTP、上下游引物各1 μmol/L、1 U AmpliTaq Gold polymerase(美国Perkin Elmer公司)。反应条件：95℃变性反应10 min，再95℃ 变性反应30 s，退火45 s，72℃ 退火45 s；共40个循环。体外甲基化DNA(美国Intergen公司)作为阳性对照，不含DNA的蒸馏水作为阴性对照。吸取PCR 产物10 μL，经12%聚丙烯酰胺凝胶电泳，溴化乙啶(efhidium bromide, EB)染色，紫外光下观察甲基化特异性引物扩增的条带情况，并进行标记，未甲基化特异性引物扩增条带标为未甲基化。实验重复进行，以确保结果的准确性。

2 结 果

3组研究对象的E-cad、ID4、ESR1、APC和HACE甲基化检测结果见表1。试验组A有19例甲基化异常，阳性率为59.38%；试验组B有10例甲基化异常，阳性率为31.25%；对照组没有检测出甲基化异常。3组差异有统计学意义(P<0.01)。试验组A中1例患者血清E-cad、ID4、ESR1、APC和HACE基因的甲基化异常检测结果见图1。

表1 3组研究对象血清E-cad、ID4、ESR1、APC和HACE甲基化异常检测结果 n

**P<0.01各组间比较

图1 试验组A中1例患者的甲基化检测结果

3 讨 论

大肠癌患者的诊断对及时治疗具有重要意义，表观遗传学改变如DNA甲基化异常在大肠癌的发生发展中发挥重要作用。既往研究[8]测定了大肠癌患者外周血游离DNA中含表皮生长因子和卵泡抑素结构域的跨膜蛋白 (TPEF)基因启动子区异常甲基化率，结果提示联合检测K-ras、TPEF基因异常可能是一种非损伤性筛选和诊断大肠癌的有效方法。此外，HSP60[9]、TIP30启动子[10]、CEA、CA19-9和CA242[11]、DLC-1[12]等基因的甲基化情况均有助于诊断大肠癌。

不同基因的甲基化情况也可反映大肠癌肝转移患者的情况，大肠癌患者和健康人的这些基因的甲基化情况不同。本研究检测了大肠癌患者血清中E-cad、ID4、ESR1、APC和HACE 基因的甲基化情况，发现32例原发性大肠癌伴肝转移患者中，19例患者的这5个基因之一甲基化异常，阳性率为59.38%；32例原发性大肠癌不伴有肝转移患者中，10例患者出现甲基化异常，阳性率为31.25%；而10名健康人没有出现基因的甲基化异常。这些结果表明，大肠癌伴肝转移患者甲基化异常的发生率较高，基因甲基化异常参与大肠癌的发生、发展。结合患者的临床资料，大肠癌相关基因的异常甲基化状态对大肠癌肝转移患者的临床诊治有重要意义，而多个基因联合检测可以提高诊断的灵敏度和特异性。

[1] 蔡三军, 彭俊杰.大肠癌肝转移的诊治进展 [J].临床肿瘤学杂志, 2006, 11(12):881-886.

[2] MESSICK C A, SANCHEZ J, DEJULIUS K L, et al.Genetic and molecular diversity of colon cancer hepatic metastases[J].Surgery, 2009, 146(2):227-231.

[3] UMETANI N, TAKEUCHI H, FUJIMOTO A, et al.Epigenetic inactivation of ID4 in colorectal carcinomas correlates with poor differentiation and unfavorable prognosis[J].Clin Cancer Res, 2004, 10(22): 7475-7483.

[4] HARDER J, ENGELSTAEDTER V, USADEL H, et al.CpG-island methylation of the ER promoter in colorectal cancer: analysis of micrometastases in lymph nodes from UICC stage Ⅰ and Ⅱ patients[J].Br J Cancer, 2009, 100(2): 360-365.

[5] KIM M S, LEE J, SIDRANSKY D, et al.DNA methylation markers in colorectal cancer[J].Cancer Metastasis Rev,2010, 29(1):181-206.

[6] SAKO N, DESSIRIER V, BAGOT M, et al.HACE1, a potential tumor suppressor gene on 6q21, is not involved in extranodal natural killer/T-Cell lymphoma pathophysiology[J].Am J Pathol, 2014, 184(11):2899-2907.

[7] JIANG T, ZHU A, ZHU Y, et al.Clinical implications of AEG-1 in liver metastasis of colorectal cancer[J].Med Oncol, 2012,29 (4):2858-2863.

[8] 许示心, 楚建军, 李莉华, 等.42 例大肠癌患者血浆TPEF异常甲基化及K-ras基因突变检测结果分析[J].南京医科大学学报:自然科学版,2008,28(2):229-232.

[9] 聂庆东, 李艳君, 张秀梅.血清肿瘤标记物及HSP60联合检测对大肠癌诊断的意义[J].中国实验诊断学,2012,16(1):52-54.

[10] 陈贝贝, 马一杰, 陈小兵, 等.抑癌基因TIP30启动子甲基化对大肠癌诊断及预后的影响[J].肿瘤防治研究,2013,40(4):349-352.

[11] 江 波, 赵先文, 韩存芝, 等.大肠癌血清CEA, CA 19-9和CA 242联合检测及其临床意义[J].肿瘤研究与临床,2006,18(9):596-599.

[12] 张素青, 刘继斌, 张一心.甲基化特异性PCR检测肝癌复发转移患者血清DLC-1甲基化的价值研究[J].肿瘤基础与临床,2009,22(3):203-205.

[本文编辑] 姬静芳

Detection of related oncogenes methylation in serum of colorectal cancer patients with liver metastasis

QI Chong，HAO Zong，HONG Liang，YIN Qing-zhang*

Department of General Surgery, the Fifth People’s Hospital of Shanghai, Fudan University, Shanghai 200240, China

Objective：To explore the detection results of serum related gene methylation in colorectal cancer patients with liver metastasis.Methods：From hospitalized patients with primary colorectal cancer from September 2011 to December 2013, 32 colorectal cancer patients with liver metastasis and 32 colorectal cancer patients without liver metastasis were selected as the experimental group A (n=30) and experimental group B (n=30), respectively.All patients did not undergo chemotherapy or radiotherapy before admission.In addition, 20 healthy subjects were recruited as the control group.DNA was extracted from serum, and E-cad, ID4, ESR1, APC, and HACE gene methylation were detected by methylation specific PCR method.Results：19 cases with E-cad, ID4, ESR1, APC or HACE abnormal methylation were detected in the experimental group A, 10 cases were detected in the experimental group B, no case was detected in the control group.There were significant differences among the three groups (P<0.01).Conclusions：Detection of serum E-cad, ID4, ESR1, APC, HACE gene methylation status is of great significance for clinical diagnosis and treatment of colorectal cancer liver metastasis.

colorectal cancer; liver metastasis; methylation; oncogene

2016-01-04[接受日期]2016-04-28

上海市卫生局基金(20114268).Supported by Foundation of Shanghai Health Bureau(20114268).

齐 翀，硕士，主治医师.E-mail: qichong8836@hotmail.com

*通信作者(Corresponding author).Tel: 021-64308151-8528, E-mail: williamyin@126.com

10.12025/j.issn.1008-6358.2016.20160009

R 735.3+4

A