减压内部沸腾法提取人面子树皮总黄酮的研究

翁艳英，张贞发，曾振芳，苏秀芳

(广西民族师范学院 化学与生物工程系 广西高校桂西南特色植物资源化学重点实验室培育基地，广西 崇左 532200 )

减压内部沸腾法提取人面子树皮总黄酮的研究

翁艳英，张贞发，曾振芳，苏秀芳

(广西民族师范学院 化学与生物工程系 广西高校桂西南特色植物资源化学重点实验室培育基地，广西 崇左 532200 )

为优化人面子树皮中总黄酮的减压内部沸腾提取工艺，提高总黄酮的提取率，采用单因素试验的方法，考察解吸及提取过程中的解吸剂体积分数、解吸时间、提取剂体积分数、提取剂用量、提取温度及提取时间等6个因素对提取效果的影响。结果表明，提取过程中提取剂体积分数影响效果最显著，其次是提取时间和提取温度，影响最小的是提取剂用量。最佳提取条件：取2.00 g人面子树皮粉末，先用4 mL 40%乙醇解吸20 min，然后用100 mL 40%乙醇在50 ℃和0.03 MPa的条件下提取2次，每次6 min。在该提取条件下进行重复试验，人面子树皮总黄酮提取率为41.51%。与传统回流提取法相比，提取时间缩短了68 min，提取率提高了9.05个百分点。说明低温快速的减压内部沸腾法对人面子树皮总黄酮的提取效果良好。

人面子； 总黄酮； 减压内部沸腾法； 正交试验

近年来，黄酮类化合物因具有较强的生物活性，越来越受到学者的关注，其药效表现在肿瘤、心血管疾病的治疗、抗菌、抗氧化活性等方面[1-2]。植物中总黄酮的提取方法主要集中在乙醇回流提取[3]、超声波提取[4]、微波提取[5-6]、超声酶法提取[7]等，其提取时间相对较长，提取温度较高，提取液中杂质多，而且微波和超声波提取要求设备费用较高。减压内部沸腾法，主要是在减压条件下低温提取，发生的内部沸腾提取强化了提取过程[8]。该法已经成功应用到多种植物黄酮[9-12]和其他成分的提取[13-16]，均取得了较好的提取效果。与传统水提或醇提相比，该法提取液中杂质少，提取温度低，有利于有效成分的后续分离纯化。

人面子系漆树科人面子属植物，又名人面树，为常绿大乔木，分布于广东、海南、广西、云南等，属于桂西南地带特有的植物，其叶、果实、果核、根及皮均可药用[17]。 黄酮类化合物是人面子的主要有效成分之一，目前对人面子总黄酮的提取研究报道较少[18]。桂西南地区人面子资源丰富，为了更好地发挥人面子药效并有效利用地方丰富植物资源，以崇左人面子树皮为原料，采用减压内部沸腾法提取人面子总黄酮，并在单因素试验基础上进行正交试验优化提取工艺，为人面子的后续开发及应用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料及仪器

人面子树皮干燥品采自广西崇左市。试剂：芦丁对照品购于上海金穗生物科技有限公司；Al(NO3)3、NaNO2、NaOH、乙醇均为分析纯，购于广东汕头市西陇化工厂。仪器：分光光度计、精密恒温浴槽、减压提取装置等。

1.2 方法

1.2.1 人面子树皮总黄酮的减压内部沸腾提取 将2.00 g的人面子树皮粉末置于50 mL烧杯中，加入一定体积分数的乙醇解吸剂润湿一段时间，使解吸剂充分渗透树皮的细胞组织，总黄酮从吸附状态中溶解下来；然后加入一定量的某体积分数的乙醇提取剂，于精密恒温槽中迅速减压至内部产生沸腾(物料表面产生小气泡)，提取一段时间，抽滤，滤渣进行第2次提取，提取方法与第1次提取相同，合并滤液，显色法分析样品，计算总黄酮提取率。

1.2.2 人面子树皮总黄酮的检测 取1.00 mL减压内部沸腾提取液稀释10倍，再取1.00 mL于25 mL比色管中，加入30%乙醇定容至12.5 mL，加入0.7 mL质量分数为5%的NaNO2溶液，摇匀后放置5 min，然后加入0.7 mL质量分数为10%的Al(NO3)3溶液，摇匀后静置6 min，接着加入5 mL质量分数为4%的NaOH溶液，混匀，30%乙醇定容至刻度，采用试剂空白作参比，在510 nm的波长下测定其吸光度。

1.2.3 标准曲线的制作 分别准确量取0 mL、2.00 mL、4.00 mL、6.00 mL、8.00 mL、10.00 mL、12.00 mL质量浓度为1.018 g/L的芦丁标准溶液于25 mL的比色管中，按照分析步骤进行显色分析，测定吸光度，以吸光度和芦丁含量绘制标准曲线，得到线性回归方程为A=0.486 4m+0.009 6，其中A为吸光度，m为芦丁含量(mg)，相关系数R2=0.999 0，在 0～1.221 6 g/L内有较好的线性关系。根据标准曲线计算总黄酮提取率，计算公式如式(1)所示：

提取率=m×n1 000×M×100%

(1)

其中：M—所称取的人面子树皮质量(g)；m—回归方程求得的总黄酮含量(mg)；n—稀释倍数。

1.2.4 减压内部沸腾法提取总黄酮的单因素试验

1.2.4.1 解吸剂体积分数对提取率的影响 准确称取2.00 g人面子树皮粉末各6份，在水浴恒温50 ℃、提取压力为0.03 MPa条件下，分别用体积分数为20%、30%、40%、50%、60%、70%的乙醇4 mL解吸25 min，然后用100 mL 40%乙醇提取8 min，考察解吸过程乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响。

1.2.4.2 解吸时间对提取率的影响 设置解吸时间分别为10 min、15 min、20 min、25 min、30 min，固定其他条件及乙醇体积分数为40%，考察解吸时间对总黄酮提取率的影响。

1.2.4.3 提取剂体积分数对提取率的影响 设置提取剂乙醇体积分数分别为20%、30%、40%、50%、60%，解吸20 min，固定其他条件，考察提取过程乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响。

1.2.4.4 提取时间对提取率的影响 设置提取时间分别为2 min、4 min、6 min、8 min、10 min，固定其他条件及提取剂乙醇体积分数为40%，考察提取时间对总黄酮提取率的影响。

1.2.4.5 提取剂用量对提取率的影响 设置提取剂乙醇用量分别为40 mL、60 mL、80 mL、100 mL、120 mL，固定其他条件及每次提取时间为6 min，考察提取剂用量对总黄酮提取率的影响。

1.2.4.6 提取温度对提取率的影响 设置提取温度分别为40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃，固定其他条件及每次提取剂用量为100 mL，考察提取温度对总黄酮提取率的影响。

1.2.5 减压内部沸腾法提取总黄酮的的正交试验 根据单因素试验结果，固定人面子树皮质量为2.00 g，解吸剂乙醇体积分数为40%，用量为4 mL，在压力0.03 MPa下进行提取试验，选择提取时间、提取温度、提取剂乙醇体积分数和乙醇用量4个提取因素作为正交试验的考察因素，每个因素取3个水平，如表1所示。

表1 正交试验因素水平

2 结果与分析

2.1 减压内部沸腾法提取总黄酮的单因素试验结果

2.1.1 解吸剂乙醇体积分数对提取率的影响 从图1可以看出，随着乙醇体积分数的增加，人面子树皮总黄酮提取率先增大，当乙醇体积分数为40%时最大，为27.84%，随后又逐渐下降，说明样品已被充分解吸，样品内外浓度达到平衡，继续提高乙醇体积分数，可能溶出其他杂质，影响总黄酮提取。因此，选定乙醇体积分数为40%。

图1 解吸剂乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响

2.1.2 解吸时间对提取率的影响 从图2可以看出，人面子树皮中的总黄酮提取率随着解吸时间的增加而增加，当解吸时间为20 min时，提取率最高，为29.07%。当解吸时间继续增加时，提取率下降。这可能是解吸时间为20 min时样品已被完全解吸。由于物料的解吸已达充分，再增加解吸时间，提取出来的杂质更多，影响总黄酮提取效果。因此，选定解吸时间为20 min。

2.1.3 提取剂乙醇体积分数对提取率的影响 从图3可以看出，随着乙醇体积分数的增加，人面子树皮中总黄酮的提取率先增大后减小，乙醇体积分数为40%时提取率最高。

图2 解吸时间对总黄酮提取率的影响

图3 提取剂乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响

2.1.4 提取时间对提取率的影响 由图4可知，随着提取时间的增加，人面子树皮中的总黄酮提取率也增大，当提取时间为6 min时提取率最大，随着提取时间继续增加，其他糖类、脂类、色素等杂质也会被提取出来，造成总黄酮提取率下降。

图4 提取时间对总黄酮提取率的影响

2.1.5 提取剂乙醇用量对提取率的影响 由图5可知， 当乙醇用量在40～100 mL， 总黄酮提取率随着提取剂用量的增加而增大，当用量超过100 mL后提取率开始下降而且幅度比较大，原因是提取剂用量在100 mL时大部分样品已被溶解完。

图5 提取剂乙醇用量对总黄酮提取率的影响

2.1.6 提取温度对提取率的影响 由图6可知，低温不利于人面子树皮物料内部沸腾，总黄酮提取率不高；温度升高，溶剂分子运动激烈，引起渗透、扩散加强，人面子树皮物料内部得到充分沸腾，在温度为50 ℃时提取率最高，继续升高温度，不仅溶剂沸腾激烈，还可能造成黄酮结构被破坏、杂质渗出等情况。

图6 提取温度对总黄酮提取率的影响

2.2 减压内部沸腾法提取总黄酮的正交试验结果

由表2可知，人面子树皮总黄酮提取率的影响因素大小依次是C>A>B>D,即提取剂乙醇体积分数>提取时间>提取温度>乙醇用量。乙醇体积分数是影响人面子树皮总黄酮提取率的主要因素，其次是提取时间。提取人面子树皮总黄酮最佳的试验组合为A2B2C2D2，即提取温度50 ℃、提取时间6 min、提取剂乙醇体积分数40%、乙醇用量100 mL。

表2 减压内部沸腾法提取总黄酮的正交试验结果

2.3 最佳提取工艺重现性试验结果

为了考察减压内部沸腾法提取人面子树皮总黄酮最佳工艺的重复性，在最佳提取条件下进行3次平行试验，分别称取2.00 g的人面子树皮，加入4 mL 40%的乙醇溶液解吸20 min，在50 ℃的恒温条件下加入100 mL 40%乙醇溶液，0.03 MPa下减压提取2次，每次6 min，合并提取液，结果显示，总黄酮提取率分别为41.96%、42.45%和40.12%，平均值达到41.51%。试验结果充分验证了正交试验优化得到的最佳提取工艺的重现性及合理性。

2.4 减压内部沸腾法与传统回流法的比较

准确称取2.00 g人面子树皮粉末3份，用100 mL 40%乙醇回流提取2次，每次60 min，测定吸光度，计算总黄酮提取率，结果见表3。由表3可知，减压内部沸腾法的提取时间短，比回流提取法缩短68 min，总黄酮提取率提高了9.05个百分点，说明减压内部沸腾提取法促进了人面子树皮总黄酮的提取，效果良好。

表3 减压内部沸腾法与传统回流法的比较

3 小结

本研究以桂西南特有植物人面子的树皮为原料，以一定体积分数的乙醇为提取剂，采用减压内部沸腾法对总黄酮进行提取，确定减压内部沸腾法提取人面子树皮总黄酮的最佳条件为：取2.00 g人面子树皮粉末,先用4 mL 40%乙醇解吸20 min，然后加入100 mL 40%乙醇，在50 ℃、0.03 MPa条件下提取2次，每次6 min。该条件下人面子树皮总黄酮的提取率达41.51%。与传统回流法相比，减压内部沸腾法提取人面子树皮总黄酮的温度低，提取时间缩短了68 min，总黄酮提取率提高了9.05个百分点，说明采用减压内部沸腾法提取人面子树皮总黄酮是可行的，这为进一步进行人面子总黄酮的分离纯化及生物活性研究奠定基础。

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Extraction of Total Flavonoids from Dracontomelon duperreanum by Decompressing Inner Ebullition

WENG Yanying,ZHANG Zhenfa,ZENG Zhenfang,SU Xiufang

(Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory Breeding Base of Chemistry of Guangxi Southwest Plant Resources, Department of Chemistry and Biology Engineering,Guangxi Normal University for Nationalities,Chongzuo 532200,China)

In order to improve the yield and optimize the extraction technology of the total flavonoids in bark ofDracontomelonduperreanumby decompressing inner ebullition,single factor experiments were conducted to investigate the effects of six factors on the extraction，including the concentration of desorption agent，desorption time，the concentration and the amount of extractant，extraction temperature and time.The results showed that the concentration of extracting agent was the key factor that affected the yield,the effects of extraction time and temperature were secondary and the amount of extraction agent was the least factor.Finally,by the analysis of data,it was found that when 2.00 g of the bark ofDracontomelonduperreanumwere desorbed for 20 minutes using 4 mL 40% ethanol and then extracted twice(6 min/time) in 100 mL 40% ethanol under 50 ℃ and 0.03 MPa,the maximum yield of total flavonoids of 41.51% was obtained.Compared with the traditional ethanol extraction,the decompressing inner ebullition extraction had the following obvious advantages that extraction time was reduced by 68 min,while the yield of total flavonoids increased by 9.05 percentage points.The study proves that the decompressing inner ebullition extraction has such characteristics as low-temperature and speediness in the extraction of total flavonoids from bark ofDracontomelonduperreanum.

Dracontomelonduperreanum; total flavonoids; decompressing innner ebullition; orthogonal test

2015-12-26

2015年广西教育厅科研项目(KY2015LX540); 广西教育厅高校科研资助项目(YB2014416)

翁艳英(1985-)，女，广西钦州人，讲师，主要从事天然产物提取纯化研究及教学工作。 E-mail:1289892514@qq.com

S792.99

A

1004-3268(2016)07-0148-05