补肾调冲方剂灌胃的卵巢早衰大鼠血清性激素水平和卵巢组织VEGF、bFGF蛋白表达变化

徐文君，高慧，李杨

(1华北理工大学,河北唐山 063000;2承德医学院附属医院)

补肾调冲方剂灌胃的卵巢早衰大鼠血清性激素水平和卵巢组织VEGF、bFGF蛋白表达变化

徐文君1，高慧2，李杨1

(1华北理工大学,河北唐山 063000;2承德医学院附属医院)

目的 观察补肾调冲方剂灌胃的卵巢早衰大鼠血清性激素水平和卵巢组织VEGF、bFGF蛋白表达变化。方法 将60只SD雌性大鼠随机分为6组，每组10只。分别设为对照组、模型组、补肾调冲方低剂量组、补肾调冲方中剂量组、补肾调冲方高剂量组、西药组。对照组正常饮水。模型组给予75 mg/kg雷公藤多苷溶液灌胃,1次/d，连续14 d。补肾调冲低、中、高剂量组大鼠上午9点给予75 mg/kg雷公藤多苷溶液灌胃，1次/d，连续14 d；下午7点分别给予6、12、24 g/kg补肾调冲方汤剂灌胃，1次/d，连续36 d。西药组大鼠上午9点给予75 mg/kg雷公藤多苷溶液灌胃，1次/d，连续14 d；下午7点给予0.625 mg/kg结合雌激素溶液灌胃，1次/d，连续36 d。实验结束后采用ELISA法检测各组大鼠血清卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)、雌二醇(E2)、孕酮(P)，采用免疫组化法测算各组大鼠卵巢组织VEGF、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)蛋白平均积分光密度(IOD)值。结果 ①与对照组相比，模型组血清FSH 、LH升高(P均<0.05)，血清E2降低(P<0.05)。与模型组相比，补肾调冲低、中、高剂量组和西药组血清FSH、LH降低(P均<0.05)，E2升高(P均<0.05)。补肾调冲低、中、高剂量组血清FSH、E2及补肾调冲低剂量组血清LH与西药组相比,P均>0.05，补肾调冲中、高剂量组血清LH高于西药组(P均<0.05)。各组血清P相比,P均>0.05。②与对照组相比，模型组卵巢组织VEGF、bFGF蛋白IOD值降低(P均<0.05)。与模型组相比，补肾调冲低、中、高剂量组和西药组VEGF、bFGF蛋白IOD值升高(P均<0.05)。补肾调冲低剂量组VEGF蛋白和补肾调冲低、中剂量组bFGF蛋白IOD值与西药组相比(P均<0.05)，补肾调冲中、高剂量组VEGF蛋白和补肾调冲高剂量组bFGF蛋白与西药组相比,P均>0.05。结论 补肾调冲方灌胃的卵巢早衰大鼠血清FSH、LH降低，E2升高，卵巢组织VEGF、bFGF表达升高。12、24 g/kg补肾调冲方汤剂灌胃的效果与0.625 mg/kg结合雌激素溶液灌胃的效果相当。

补肾调冲方；卵巢早衰；卵泡刺激素；黄体生成素；雌二醇；孕酮；血管内皮生长因子；碱性成纤维细胞生长因子

卵巢早衰主要表现为女性40岁以前出现的性器官萎缩及持续闭经，发病率逐年增加且呈现低龄化趋势。卵巢早衰患者促卵泡刺激素(FSH)及黄体生成素(LH)升高，雌二醇(E2)降低。中药补肾调冲方是根据“肾主生殖”“冲任学说”等理论创立的方剂[1]。主要组成为菟丝子、巴戟天、肉苁蓉、补骨脂、当归、川芎、熟地、五味子、紫石英九味中药。全方合用共奏滋补肝肾,平衡阴阳,疏达肝气, 调理冲任气血之效[2]。临床上使用本方治疗卵巢早衰取得了较好的效果，但其机制不明。本研究在用雷公藤多苷片制作大鼠卵巢早衰动物模型的同时给予补肾调冲方汤剂灌胃，观察大鼠血清FSH、LH、E2、孕酮(P)水平和卵巢组织VEGF、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)表达变化，旨在探讨补肾调冲方汤剂治疗大鼠卵巢早衰的机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 SPF级SD雌性大鼠20只，12周龄，体质量250～270 g,由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，许可证号SCXK(京)2014-0004。中药补肾调冲方组方由菟丝子15 g、黄精15 g、熟地15 g、肉苁蓉10 g、巴戟天10 g、当归10 g、川芎6 g、紫石英15 g、五味子6 g组成，药品购自安国市长安中药材有限公司，批号20150824,由同济大药房按常规方法煎煮，滤纸浓缩至生药2.5 g/mL，4 ℃冰箱储存备用。雷公藤多苷片每片含雷公藤多苷10 mg，购自远大医药黄石飞云制药有限公司，批号20150617,研碎后加入等体积双蒸水融化，稀释后备用。结合雌激素片规格0.625 mg/片，购自新疆新资源生物制药有限责任公司，批号20150608,研碎后加入等体积双蒸水融化,稀释后备用。大鼠的FSH、LH、E2、P酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒购自上海联科生物技术有限公司，批号20150605；兔抗鼠VEGF多克隆抗体购自北京博奥森公司；兔抗鼠bFGF多克隆抗体购自北京中杉金桥生物科技有限公司；即用型免疫组化试剂盒购自北京四正柏生物科技有限公司。Multiskan MK3酶标仪购自芬兰Thermo公司；Thermo ExcelsiorTMES自动组织脱水机购自美国Thermo Electron公司;显微镜照相系统购自德国Lecia公司。

1.2 大鼠分组及造模、补肾调冲方应用方法 将60只SD雌性大鼠随机分为6组，每组10只，分别为对照组、模型组、补肾调冲低剂量组、补肾调冲中剂量组、补肾调冲高剂量组、西药组。对照组自由饮水。模型组给予75 mg/kg雷公藤多苷溶液灌胃,1次/d，连续14 d。补肾调冲低、中、高剂量组大鼠上午9点给予75 mg/kg雷公藤多苷溶液灌胃，1次/d，连续14 d；下午7点分别给予6、12、24 g/kg补肾调冲方汤剂灌胃，1次/d，连续36 d。西药组大鼠上午9点给予75 mg/kg雷公藤多苷溶液灌胃，1次/d，连续14 d；下午7点给予0.625 mg/kg结合雌激素溶液灌胃，1次/d，连续36 d。

1.3 各组血清性激素水平检测 用药完成后将各组大鼠麻醉，腹主动脉取血，静置、离心分离血清，采用ELISA法检测FSH、LH、E2、P。操作按试剂盒说明书进行。

1.4 各组卵巢组织VEGF、bFGF蛋白检测 用药完成后将各组大鼠麻醉，无菌取卵巢组织，多聚甲醛固定，自动脱水机脱水，石蜡包埋，常规切片后待测。检测时将切片脱蜡，PBS清洗，微波炉内梯度加热，滴加H2O2和封闭液后，继续用PBS冲洗，滴加VEGF、bFGF抗体，抗体浓度为1∶50，37 ℃温箱内孵育30 min，4 ℃过夜。次日加辣根过氧化物酶标记链霉卵白素工作液、二抗工作液，37 ℃孵育25 min，DAB显色，苏木素复染,中性树胶封片。显微镜下观察，阳性区域呈棕黄色。200倍光镜下用显微摄像系统随机摄取5个视野，用IPP6.0软件测算VEGF、bFGF平均积分光密度(IOD)值。

2 结果

2.1 各组血清性激素水平比较 各组血清FSH、LH、 E2、P水平见表1。与对照组相比，模型组血清FSH 、LH升高(P均<0.05)，E2降低(P<0.05)。与模型组相比，补肾调冲低、中、高剂量组和西药组血清FSH、LH降低(P均<0.05)，E2升高(P均<0.05)。补肾调冲低、中、高剂量组血清FSH、E2及补肾调冲低剂量组血清LH与西药组相比,P均>0.05，补肾调冲中、高剂量组血清LH高于西药组(P均<0.05)。各组血清P相比,P均>0.05。

表1 各组血清FSH、LH、 E2、P水平比较

注:与对照组相比，#P<0.05；与模型组相比，△P<0.01；与西药组相比，#P<0.05。

2.2 各组卵巢组织VEGF、bFGF蛋白比较 各组卵巢组织VEGF、bFGF蛋白IOD值见表2。与对照组相比，模型组卵巢组织VEGF、bFGF蛋白IOD值降低(P均<0.05)。与模型组相比，补肾调冲低、中、高剂量组和西药组VEGF、bFGF蛋白IOD值升高(P均<0.05)。补肾调冲低剂量组VEGF蛋白和补肾调冲低、中剂量组bFGF蛋白IOD值与西药组相比,P均<0.05，补肾调冲中、高剂量组VEGF蛋白和补肾调冲高剂量组bFGF蛋白与西药组相比,P>0.05。

3 讨论

雷公藤多苷为中草药雷公藤根茎提取物中的活性成分，具有抗炎、抗肿瘤等活性成分，广泛应用于治疗肾炎、类风湿性关节炎等疾病,但其毒性明显，长期使用会对消化系统、生殖系统、血管等造成损害[3]。高慧教授发现使用雷公藤药物制剂治疗类风湿性关节炎、肾炎等疾病时，可引起女性月经不调及闭经等症状，因此怀疑雷公藤多苷片可损伤卵巢功能，并首创使用雷公藤药物制剂制作大鼠卵巢早衰模型[4]。

表2 各组卵巢组织VEGF、bFGF蛋白IOD值比较

注：与对照组相比，#P<0.05；与模型组相比，△P<0.05；与西药组相比，#P<0.05。

FSH、LH水平是反映卵巢储备功能力的间接指标，FSH、LH水平升高与卵巢储备能力降低有关。E2是在FSH的作用下由窦状卵泡产生。随着卵泡库存的减少，E2水平逐渐降低，从而导致FSH升高，因此E2可作为检测卵巢储备力的直接指标[5]。FSH是刺激卵泡发育的最首要激素，也可用来监测药物对卵巢的损伤程度[6]。临床上认为血清FSH>10 IU/L者可能处于卵巢功能衰退的隐匿期,FSH进一步升高即可认为卵泡储备功能降低。若血清FSH一次测定高于30 IU/L,即可诊断高促性腺激素血症。若间隔一个月以上两次测定FSH>40 IU/L,则患者可能己经发展为卵巢早衰[7]。本研究发现造模后大鼠血清FSH、LH水平升高，E2水平降低，说明造模成功。补肾调冲方各剂量组在造模同时，给补肾调冲方汤剂灌胃，用药完成后，大鼠血清FSH、LH水平较模型组低，E2水平高，且以中、高剂量组干预效果明显，提示补肾调冲方能有效提高血清E2水平，降低血清FSH、LH水平。

卵巢早衰的原因主要是原始卵泡储备过少、闭锁或者耗竭太快。卵巢血流是维持卵泡生长,类固醇激素分泌及卵泡对促性腺激素敏感性的重要因素[8]，VEGF、bFGF为血管内皮生长因子，可修复受损卵泡，改善受损卵巢血管通透性，尤其可以特异性的促进类固醇激素生成器官的细胞增殖存活和趋化[9]，促进新生血管生成。bFGF在黄体生成中起到重要的作用，主要表现在能促进卵泡黄体的生长发育，还能给黄体实体提供营养[10]。有研究报道，卵巢血流的80%～90%是供给黄体的[11]。本研究结果显示，与对照组相比，模型组VEGF及bFGF的表达降低，表明卵巢早衰大鼠卵巢血管新生能力受损。补肾调冲低、中、高剂量组卵巢组织VEGF及bFGF的表达量与模型组相比增加，中高剂量组效果显著，说明补肾调冲方中剂量即可促进卵巢早衰大鼠卵巢组织的血管新生。笔者推测这与补肾调冲方中当归养血活血、川芎活血调经的作用有关。

补肾调冲法[12]含义为滋补肝肾，平衡阴阳，疏达肝气，调理冲任气血，补肾实则补五脏六腑之虚，调冲即是疏泄肝木，调理冲任气血阴阳，使之达到冲和的状态。补肾调冲方[13]以菟丝子、巴戟天、黄精、熟地黄、肉苁蓉补肾，以当归、川芎、紫石英调冲为主的两大部分组成。方中巴戟天性润而不燥，补肾阳益精血；菟丝子能温肾壮阳，调补冲任；黄精平补三脏，强壮固本；熟地黄生精血、补五脏、通血脉；肉苁蓉可养命门、滋肾气；当归可破宿血，补不足；川芎可下调经水；紫石英为血肉有情之品，可治疗不孕及补诸不足。诸药合用可通调气血，滋阴补肾，平衡阴阳，充分体现了中药治病调整体内外环境的平衡状态、以平为期、以和为目的的理念。现代研究也表明[14]，活血药可促进内生殖器血液循环，丰富神经营养，增加卵巢等内分泌腺体的血供，改善子宫、卵巢血供，促进卵泡发育。综上所述，补肾调冲方灌胃的卵巢早衰大鼠血清FSH、LH降低，E2升高，提高卵巢组织VEGF、bFGF表达。12、24 g/kg补肾调冲方汤剂灌胃的效果与0.625 mg/kg结合雌激素溶液灌胃的效果相当。

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河北省省级重大医学科研项目(zyzd2013018);河北省政府资助临床医学优秀人才培养项目(2014571024)；国家中医药管理局全国名老中医药专家高慧传承工作室建设项目(2015048157)。

高慧(E-mail: gaohuihbcd@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.47.012

R711.75

A

1002-266X(2016)47-0041-03

2016-07-15)