高邮鸭IGF-1基因SNP位点变异与骨骼肌生长发育相关性分析

陶志云，朱春红，宋卫涛，徐文娟，刘宏祥，章双杰，李慧芳

（江苏省家禽科学研究所，扬州 225125）

高邮鸭IGF-1基因SNP位点变异与骨骼肌生长发育相关性分析

陶志云，朱春红，宋卫涛，徐文娟，刘宏祥，章双杰，李慧芳*

（江苏省家禽科学研究所，扬州 225125）

胰岛素样生长因子1（IGF-1）是动物生长轴重要基因之一，在调节动物生长发育和代谢中具有重要作用。采用LDR法检测IGF-1基因在高邮鸭群体中多态性，筛选与高邮鸭骨骼肌生长性状相关SNP位点。结果表明，在IGF-1基因第二内含子上检测到g.110 431G＞T突变，形成GG、GT、TT三种基因型，该突变位点具有中度多态信息含量，在高邮鸭中处于哈代-温伯非平衡状态。相关分析表明，该突变位点与70日龄体重、胸腿肌重、胸肌肌纤维面积和直径、腿肌肌纤维密度显著相关，可作为高邮鸭生长发育早期选育分子标记。

胰岛素样生长因子1；LDR；SNP；高邮鸭

胰岛素增长因子1（IGF-1）属胰岛素家族成员，是动物生长轴重要基因之一，调控动物生长发育和代谢，在细胞生长和分化调节中起重要作用[1]。研究表明，IGF-1主要在动物出生后生长发育中作用，IGF-1突变与出生重和体长无相关性[2]，发挥影响动物生长候选基因。禽类IGF-1研究主要见于鸡，不同鸡种IGF-1表达量比较研究表明，整个生产过程中，IGF-1在大围山微型鸡中表达量显著低于武定鸡和艾维茵肉鸡；三个品种中IGF-1表达量与生长性状（体重、体斜长、胸骨长、胸宽、胸深、胫长、胫管围）显著相关[3]。沈华等认为黄羽肉鸡IGF-1外显子1上1处突变与鸡初生重、4周龄、12周龄及300日龄成年体重显著相关[4]。万秋蓓等对新扬州鸡研究表明，IGF-1基因5'调控区Pst1位点和HinfI位点多态性与繁殖性状显著相关[5-6]，朱文奇等对文昌鸡和边鸡研究表明，IGF-1多态性与鸡繁殖性状相关[7-9]。近年关于鸭IGF-1相关研究中，北京鸭IGF-1 mRNA表达量与胸肌发育正相关[10]；胡艳等对金定鸭和高邮鸭研究表明，发育早期肝脏中IGF-1 mRNA表达量持续上升，与鸭体质量显著相关[11]；淮南麻鸭IGF-1基因单核苷酸多态性与体重正相关[12]。张绍胜等提出IFG-1多态性与生长及屠宰性状相关[13-14]。以上结果表明，IGF-1在禽类生长发育中具有重要作用。

高邮鸭，又名高邮麻鸭，是中国三大名鸭之一，属蛋肉兼用型地方优良品种。高邮鸭不仅生长快、肉质好、产蛋率高，且耐粗饲、适应性强、蛋头大、蛋质好，因善产双黄蛋乃至三黄蛋而享誉海内外。但目前高邮鸭育种基本采用传统方法，无法满足日益增长消费需求。因此，本文以高邮鸭为研究对象，筛选IGF-1基因单核苷酸多态性，并与70日龄高邮鸭体重、胸腿肌重及胸腿肌肌纤维性状关联分析，以期为高邮鸭选育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选择0日龄高邮鸭260只，购自江苏高邮鸭集团，在相同日粮水平条件下饲养。试验所用主要试剂TaqDNA聚合酶（Sigma aldrich Z266272）购自天根生化科技（北京）有限公司；dNTP（Promega U1511）购自上海玉博生物科技有限公司；PCR仪（Gene Amp PCR system 9 600）购自Norwalk，CT.06859 USA；电泳仪（JY600+）购自北京君意东方电泳设备有限公司；全自动紫外与可见分析装置（FR-200A）购自上海复日科技有限公司；测序仪（PRISM 3730）购自ABI公司。

1.2 血液样品采集

70日龄时对高邮鸭称重，屠宰和采血，采用1次性注射器从鸭翅静脉中抽取1 mL血液，注入经高压灭菌并装有200 μL 2%无菌乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝剂的1.5 mL离心管中，轻轻摇匀，记录翅号，-80℃保存备用。

1.3 生长性状测定

70日龄高邮鸭活体称重后屠宰，解剖后分离出胸大肌和腓肠肌称重（下文胸肌和腿肌分别是指胸大肌和腓肠肌）。截取胸大肌和腓肠肌中间膨大部冰冻切片并HE染色，染色后每个个体至少取3个切片拍照，计算肌纤维面积、直径和密度，取平均值。

1.4 DNA提取和PCR扩增

采用苯酚-氯仿法抽提基因组DNA，经琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测纯度和浓度，并将DNA稀释成50 ng·μL-1，作为PCR扩增模板。根据GenBank上鸭IGF-1基因（NW_004677293）序列设计引物，上游引物序列为5'TTGCATG GAGTG GATGTGAT 3'；下游引物序列为：5'GC AGGAA TAAGAGTGCCATGT 3'。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。在PCR反应条件下扩增，PCR产物大小234 bp。PCR扩增体系为20 μL：10×buffer 2 μL，3 mmol·L-1Mg2+0.6 μL，dNTP mix 40 mmol·L-12 μL，1 U·μL-1Taq聚合酶0.2 μL，10 μmol·L-1上下游引物Mix 2 μL，补ddH2O至20 μL。在Perkin-Elmer Gene Amp PCR Systems 9600上扩增反应，PCR扩增反应程序为：95℃变性2 min，40次循环（94℃30 s，50℃30 s，65℃30 s），65℃延伸10 min，得到PCR扩增产物。反应结束后，取2 μL反应产物2%琼脂糖凝胶，0.5×TBE中电泳，检测反应成功率，剩余反应产物-20℃保存。

1.5 SNP检测与基因型分型

PCR产物连接酶检测反应（LDR），设计三条LDR探针，序列如下：

连接酶检测反应体系为10 μL，包括：4 μL PCR扩增产物、1 μL 10×Buffer、1 μL Probe mix（2 pmol·μL-1）、0.05 μLTaqDNA ligase（2 U·μL-1）、加ddH2O补足10 μL，充分混匀后短暂离心，最后加入10 μL石蜡油。连接酶检测反应程序为：①95℃预变性2 min；②94℃变性15 s，50℃退火25 s，40次循环。反应完成后，在每个上样孔中加入10 μL Loading Buffer，0.25 μL ABI GS-500 ROX荧光标记分子质量标准，最后加入0.5 μL LDR产物。充分混匀后上样，ABI377测序仪测序胶毛细管电泳，并用GENESCANTM672软件收集数据、校正泳道线、测量迁移片段并校正内在分子质量标准。LDR反应产物由ABI3730型基因分析仪检测，根据LDR产物长度与各基因型通过Genemapper关联分析。

1.6 数据分析

1.6.1 Hardy-Weinberg平衡检验

假设某群体某位点等位基因有A、B两种，其等位基因频率分别为p、q。

该群体基因型有AA、AB、BB三种，基因型频率分别记为D、H和R。根据观测基因型频率，可计算等位基因频率：

根据等位基因频率，可计算理论基因型频率：

根据样本含量、观测基因型频率和理论基因型频率，可分别计算观测基因型频数和理论基因型频数。

通过卡方检验：

计算卡方值。如果卡方值对应概率＞0.05，则可认为该等位基因处于Hardy-Weinberg平衡状态。

1.6.2 多态信息含量

其中Pi、Pj分别为第i、j个等位基因频率，n为等位基因个数。

1.6.3 有效等位基因数

其中Pi为某一位点上第i个等位基因频率，n为等位基因个数。

利用SPSS 16.0软件检验基因型频率和基因频率，分析与骨骼肌性状相关性，作Hardy-Weinberg平衡卡方适合性检验，计算多态信息含量。

2 结果与分析

2.1 LDR分型及SNP位点信息

通过LDR法，对252只高邮鸭个体IGF-1基因作基因分型。LDR反应产物由ABI3730型基因分析仪检测，根据LDR产物长度与各基因型通过Genemapper关联分析，分型图见图1，基因型GG的LDR产物长度170 bp，基因型TT的LDR产物长度172 bp，基因型GT的LDR产物长度170和172 bp混合。IGF-1基因具有4个外显子，在NW_004677199.1序列中分别位于89 201:90 285、100 673:100 854、136 234:136 390和140 698:140 977处。IGF-1基因110 431位点发现有g.110 431G＞T突变（见图1），该位点位于IGF-1基因内含子2的第9 577位点。其中GG、GT和TT基因型分型图谱见图2。GG、TT基因型均只有1个检测峰，GT基因型有两个并列检测峰。

2.2 IGF-1基因g.110 431G＞T SNP位点在高邮鸭分布情况

根据IGF-1基因g.110 431G＞T SNP位点在高邮鸭中基因型分布情况，统计基因型及基因频率，检测60个GG基因型、48个GT基因型、144个TT基因型。根据基因型分布情况，利用SPSS软件皮卡逊卡方值作基因型频率卡方适合性检验，由表1可知，高邮鸭突变位点χ2为41.236，P=0.000＜0.05，说明高邮鸭在该突变位点上处于哈代-温伯非平衡状态。根据等位基因频率算出突变位点多态信息含量（PIC）和有效等位基因数（Ne）。PIC值为0.372，介于0.25～0.5，说明该SNP位点为中度多态。

图1 IGF-1基因SNP位点三种基因型分型图谱Fig.1 Three genotypes of SNP of IGF-1

图2 SNP位点所处IGF-1基因第二内含子部分序列Fig.2 Part sequence of intro 2 of IGF-1 gene containing the SNP

表1 IGF-1基因g.110 431G＞T SNP位点在高邮鸭中的分布情况Table 1 Distribution of g.110 431G＞T SNP of IGF-1 in Gaoyou duck

2.3 IGF-1基因g.110 431G＞T SNP与高邮鸭体重及胸腿肌重关联分析

对IGF-1基因SNP分子标记不同基因型与70日龄高邮鸭体重、胸肌重和腓肠肌重关联分析，结果见表2。由表2可知，IGF-1基因SNP位点与高邮鸭体重、胸肌重差异极显著（P＜0.01）；与腿肌重差异显著（P＜0.05）；其中基因型GG 70日龄高邮鸭体重、胸肌重和腿肌重均显著高于基因型GT和TT；比较GT和TT，GT型70日龄高邮鸭体重和胸肌重显著高于TT，腿肌重在两基因型间差异不显著（P＞0.05）。

2.4 IGF-1基因g.110 431G＞T SNP与70日龄高邮鸭胸肌肌纤维特性关联分析

将胸腿肌冰冻切片并HE染色，Image-Pro Plus 6.0软件统计每个肌纤维面积、直径和密度，结果见图3。

IGF-1基因SNP位点不同基因型与70日龄高邮鸭胸腿肌肌纤维特性关联分析，结果见表3。

表2 IGF-1基因g.110 431G＞T SNP与70日龄高邮鸭体重及胸腿肌重关联分析Table2Correlation analysis of g.G110 431G＞T SNP of IGF-1 gene with the body weight,chest muscle weight and leg muscle weight of 70 days-age Gaoyou duck

图3 肌纤维Fig.3 Sketch map of muscle fiber

表3 IGF-1基因g.110431G＞T SNP与70日龄高邮鸭胸腿肌肌纤维特性关联分析Table 3 Correlation analysis of 70 days age Gaoyou duck muscle fiber characteristics of chest and leg with g.110 431G＞T SNP of IGF-1 gene

由表3可知，胸肌中IGF-1基因g.110 431G＞T SNP位点与70日龄高邮鸭胸肌肌纤维面积、肌纤维平均直径差异显著（P＜0.05），与肌纤维密度差异不显著（P＞0.05）；其中基因型GG 70日龄高邮鸭胸肌纤维面积和直径均显著高于基因型GT和TT，胸肌纤维面积显著低于基因型GT和TT（P＜0.05）；比较GT和TT，胸肌纤维面积、直径和密度间差异均不显著（P＞0.05）。腿肌中，IGF-1基因g.110 431G＞T SNP位点与70日龄高邮鸭腿肌肌纤维面积、平均直径相关不显著（P＞0.05），与腿肌肌纤维密度差异显著（P＜0.05），其中，基因型GG 70日龄高邮鸭腿肌肌纤维密度显著高于基因型GT和TT（P＜0.05），而腿肌肌纤维面积和直径在GG、GT和TT基因型间差异不显著（P＞0.05）。

3 讨论

IGF-1基因多态性在多种动物研究中均有报道，研究表明，大西洋鲑鱼中IGF-15763G＞T、7292C＞T、4671A＞C三个突变位点与体重相关[15]。牛IGF-1多态性与其断奶重[16]、产奶量、体况评分和奶牛繁殖力性状相关[17]。猪IGF-1外显子3突变与猪生长性状相关[18]。武艳平等在泰和乌鸡IGF-1第1外显子发现1处突变，该突变AB基因型体重显著高于AA基因型体重[19]。王洪才等发现庄河大骨鸡IGF-1的5'非编码区1处突变形成CC、CD和DD基因型，在活重、屠体重、半净膛重、腿肌重和平均日增重方面，DD基因型个体均显著高于CC型和CD型个体[20]。研究表明，IGF-1是影响动物生长繁殖等性能重要基因。黄慧蓉等研究表明，IGF-1多态性与山麻鸭产蛋性能相关[21]。本试验在高邮鸭IGF-1中发现一个单核苷酸突变位点，该突变位点与高邮鸭70日龄体重、胸腿肌重显著相关，GG基因型体重显著高于GT和TT基因型。本试验中体重最高GG基因型组，其胸肌和腿肌重也最高，与Sato等研究结果一致[22]。试验表明，GG基因型为体重增长优势基因型。

肌纤维特性研究表明，肌纤维组织学特性与肌肉品质密切相关。如北京油鸡、福建和田鸡、泰宁乌凤鸡三个地方品种鸡纤维特性与肌肉嫩度研究表明，胸肌和腿肌剪切力与肌纤维直径显著正相关，与肌纤维密度显著负相关[23]。5个品系优质鸡肌纤维生长规律及肉品质关系研究结果表明，肌纤维面积与密度显著负相关，与嫩度、肉色、肌内脂肪含量、肌甘酸含量正相关[24]。为进一步研究IGF-1多态性与胸腿肌肌纤维特性相关性，本文分析和统计胸腿肌的肌纤维面积、直径和密度，并关联分析胸腿肌肌纤维面积、直径和密度与IGF-1多态性，结果表明，在胸肌中，GG基因型胸肌纤维面积和直径显著高于GT和TT基因型，GG基因型密度显著低于GT和TT基因型，GG基因型胸肌肌纤维密度显著低于GT和TT基因型，说明胸肌肌纤维面积和直径与IGF-1在g.110 431G＞T多态性显著相关。在腿肌中，腿肌肌纤维面积GG与GT基因型间差异显著，与TT基因型间差异不显著；腿肌肌纤维直径在GG、GT和TT基因型间差异不显著；腿肌肌纤维密度GG基因型显著低于GT和TT基因型，说明腿肌肌纤维密度与IGF-1在g.110 431G＞T多态性显著相关。

肌纤维特性是衡量肌肉品质重要指标，肌纤维直径越小，密度越大，则肉质越嫩。体重、胸腿肌重和基因型间相关性分析表明，GG基因型有利于高邮鸭体重、胸腿肌重增长，但同时肌纤维特性与基因型间相关性分析表明，GG基因型鸭肉质嫩度低。综合考虑体重增长和肉质因素，建议选择TT基因型，可获得肉质好、生长快高邮鸭新品系。

4 结论

本研究通过高邮鸭IGF-1基因第2内含子多态位点检测，发现g.110 431G＞T突变位点，形成GG、GT、TT三种基因型。通过与70日龄体重、胸腿肌重、胸腿肌肌纤维面积、直径和密度关联分析，该突变位点与70日龄体重、胸腿肌重、胸肌肌纤维面积、直径和腿肌肌纤维密度显著相关，提示该位点可作为高邮鸭生长发育早期选育分子标记。

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Polymorphism ofIGF-1 gene and relationship between genotypes and skeletal muscle development traits in Gaoyou duck/

TAO Zhiyun,ZHU Chunhong,SONG Weitao,XU Wenjuan,LIU Hongxiang,ZHANG Shuangjie,LI Huifang(Jinagsu lnstitute of Poultry Science,Yangzhou Jiangsu 225125,China)

Insulin growth factor 1(IGF-1)is one of the important gene of animal growth axis.The polymorphism ofIGF-1 gene was detected in Gaoyou duck.The association betweenIGF-1 gene polymorphism and growth traits of Gaoyou duck was analysed.The results showed that one single nucleotide polymorphism(SNP)was detected in intron 2 ofIGF-1 gene,which was g.110 431G＞T.The mutation formed GG,GT and TT genotype.The PIC was 0.372,and the mutation site was not in Hardy-Weinberg equilibrium in Gaoyou duck.The results of correlation analysis showed that there were significantly correlation between the mutation site and body weight,chest muscle weight,leg muscle weight,area and diamete of breast rmuscle fiber,and density of leg muscle fiber of 70 days-age Gaoyou duck.It was suggested that the mutation site could be used as a molecular marker of Gaoyou duck to accelerate the breeding process.

insulin growth factor 1;LDR;SNP;Gaoyou duck

S834

A

1005-9369（2016）12-0086-07

时间2016-12-28 10:33:00 [URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20161228.1033.018.html

2016-08-11

江苏省农业科技自主创新项目（CX（15）1010-03）

陶志云（1979-），女，助理研究员，硕士，研究方向为家禽免疫及遗传育种。E-mail:zhiyun2@126.com

*通讯作者：李慧芳，研究员，博士，研究方向为家禽遗传育种与资源保护。E-mail:lhfxf_002@aliyun.com

陶志云,朱春红,宋卫涛,等.高邮鸭IGF-1基因SNP位点变异与骨骼肌生长发育相关性分析[J].东北农业大学学报,2016,47 (12):86-92.

Tao Zhiyun,Zhu Chunhong,Song Weitao,et al.Polymorphism ofIGF-1 gene and relationship between genotypes and skeletal muscle development traits in Gaoyou duck[J].Journal of Northeast Agricultural University,2016,47(12):86-92.(in Chinese with English abstract)