参芪扶正液使化疗增效的代谢通路初探——维生素K2代谢

林晓洁，关若丹，司徒红林，戴燕，许锐，宋雪，丘嫦，郭倩倩，林毅，陈前军

广东省中医院大学城医院乳腺科，广东 广州 510006

参芪扶正液使化疗增效的代谢通路初探
——维生素K2代谢

林晓洁，关若丹，司徒红林，戴燕，许锐，宋雪，丘嫦，郭倩倩，林毅，陈前军

广东省中医院大学城医院乳腺科，广东 广州 510006

目的：通过液相色谱质谱法对乳腺癌新辅助化疗患者接受参芪扶正液治疗前后的血浆代谢产物的对比分析，寻找参芪扶正液对乳腺癌新辅助化疗增效的重要代谢通路，并以此建立其与扶正法抗瘤的联系。方法：采用前瞻性随机对照研究，纳入参芪扶正液治疗组患者17例、对照组患者18例，收取每例患者化疗前后血标本，共70份标本。应用超高效液相色谱质谱技术，获得代谢轮廓图谱，并运用偏最小二乘判别分析和共识正交偏最小二乘判别分析模式识别技术，对得到的谱图积分进行分析，根据质谱同位素（质荷比）匹配HMDB数据库，对化疗前后血浆潜在的生物标志物进行鉴定。结果：治疗组和对照组化疗后的血浆代谢状态与化疗前比较完全发生了分离；化疗后，对照组中维生素K2、伞形花内酯降低，差异有统计学意义（P＜0.05），而治疗组中无明显变化，差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：参芪扶正液能维持乳腺癌新辅助化疗患者体内维生素K2和伞形花内酯的代谢平衡，这可能是其达到化疗增效作用的重要环节。

乳腺癌；参芪扶正液；代谢组学；维生素K2

研究证明[1]，参芪扶正注射液联合放化疗能提高放疗、化疗的近期疗效，改善生活质量、降低毒副反应。本研究中35例患者在前期临床上新辅助化疗的临床疗效评估亦提示参芪扶正液干预的治疗组略优于对照组(临床缓解率：58.8%(10/17) VS 50.0%(9/18))，但参芪扶正液在人体中经过复杂代谢后，是怎样达到对化疗减毒增效的作用，其可能的作用靶点是什么，仍然不清楚。本研究试图通过代谢组学方法寻找出参芪扶正液对乳腺癌新辅助化疗增效的重要代谢通路，并阐述其与扶正法抗瘤的联系。

1 临床资料

观察病例为2014年2月—2015年1月于广东省中医院乳腺科住院接受新辅助治疗的乳腺癌患者共35例，病理类型均为浸润性导管癌。治疗组17例，平均年龄(50.4±9.9)岁；对照组18例，平均年龄(56.3±12.3)岁。2组患者临床分期、组织学分级、HER-2状态、化疗方案情况经检验，差异均无统计学意义(P＞0.05)，见表1。所有患者均无严重心、肺、肝、肾功能不全。

2 治疗方法

2.1 对照组 患者均根据病情接受相应的新辅助化疗，HER-2阳性者同时联合赫赛汀治疗至1年。本研究中采用的化疗方案有TEC、EC、TCH、FEC。

表1 一般资料比较(±s) 例

表1 一般资料比较(±s) 例

注：上表P值取自χ2检验或Fisher’s确切概率法；①数据由确切概率法计算得出。

项目临床分期ⅢA期ⅢB期ⅢC期组织学分级1级2级3级H ER-2状态阴性阳性化疗方案TEC EC TCH FEC治疗组(n=17)对照组(n=18)P值10 1 6 0 9 0 9 2 0.50①130.26①4 6 14 2 100.23 11 7 7 2 1 8 4 8 2 4 0.45①

2.2 治疗组 在对照组治疗方案的基础上，于化疗当天至化疗后第6天连续予参芪扶正注射液(由丽珠集团利民制药厂提供，规格：每瓶250 mL，注射剂；批号：219990065)，静脉滴注：每次250 mL，每天1次，周期为21天，共3周期。

2组分别于化疗开始前1天，第3周期化疗后第10天留取血浆，共70份标本。化疗3周期结束后评估化疗疗效。

3 观察指标与统计学方法

3.1 仪器和试剂仪器 Waters UPLC超高效液相色谱系统，配备自动进样器。质谱检测采用AB SCIEX Triple TOF 5600高分辨质谱仪，配有ESI电离源。VORTEX-5涡旋混合器(江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司)；AllegraTM X-22台式高速冷冻离心机(Beckman Coulter，美国)。

3.2 试剂 HPLC级乙腈、甲醇购自Merck公司(Darmstadt，Germany)，甲酸购自Fluka公司(Buchs，Switzerland)。其它试剂均为市售分析超纯水(18.2MΩ)由本实验室Milli-Q超纯水系统(Millipore，France)制备。

3.3 样本的采集与处理 ①样本采集：人血浆(EDTA抗凝)样品；采集时间：首次化疗前空腹抽血，第3周期化疗结束后第10天空腹抽血(非抗凝血管支，约3 mL)，采集后立即-80℃冷冻保存。②样品前处理：将保存的血浆4℃冻融后，振荡混合均匀，取200 μL，置1.5 mL EP管中，加入乙腈800 μL，2 000 r/min涡旋混合2 min，置高速离心机中，13 000 r/min，离心20 min，取上清液置2 mL进样小瓶中。

3.4 数据采集与统计学方法 ①数据采集及预处理：采用AB SCIEX公司的Analyst软件对LC-MS的结果进行数据采集，得到血浆代谢的指纹图谱。采用MarkerView4.1软件对代谢指纹图谱进行数据分析处理，进行色谱合并，峰判别、峰对齐和归一化等预处理。②多元统计分析方法：经预处理后的各样本量化信息数据导入SIMCA-P14.0软件用于多维统计，运用偏最小二乘判别分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)模式识别技术，对得到的谱图积分进行分析，比较对照组的受试者与治疗组的受试者血浆代谢成分的差异，得到对分组贡献最大的一组谱峰，结合t检验等统计学方法，得到不同分组情况下，样本间的聚类情况，找出与分组相关的体内小分子化合物，根据化合物在样本聚类中的贡献度大小，对采用模式识别分析得出的化合物在各组间的差异进行了两两间检验分析，从不同临床意义角度出发，找出组间差异性较大的化合物。

4 研究结果

4.1 典型代谢指纹图谱 见图1。图1分别为对照组化疗前、化疗后，治疗组化疗前、化疗后的代谢轮廓。每一个波峰代表一个代谢物，本研究共检测到3074种代谢物，但现代技术目前能鉴别出来的代谢物仅有数百种，我们只需找出各组中含量差异较大的代谢物，并作鉴定。

4.2 化疗前后差异代谢物分析及鉴定

4.2.1 2组化疗前后血浆差异代谢物鉴定 见表2。根据OPLS-DA模型中的VIP值(VIP＞1)和t检验结果，筛查出2组间差异有统计学意义(P＜0.05)的化合物。即对分类贡献较大的特异性代谢物，经鉴定共有13个(以不同的质荷经-保留时间表示不同的代谢物)。

图1 血浆代谢UPLC-TOF指纹图谱

表2 2组化疗前后血浆差异代谢物鉴定 (13个) (根据归一化积分值比较P值)

4.2.2 （正交）偏最小二乘法模型 见图2。将血浆对照组化疗前后与治疗组化疗前后的数据进行PLS-DA和OPLS-DA分析，得到score图(图2-A、C、D)和loading图(图2-B)，分别提示不同组别的代谢状态、聚类关系和化合物差异分布。

4.2.3 化疗前后血浆差异代谢物鉴定 见表3。根据质谱同位素(质荷比)匹配HMDB数据库的检索结果(http：//www. hmdb.ca)及查阅文献后，结合化合物的生物学、临床意义，对化疗前后血浆潜在的生物标志物(差异代谢物)进行鉴定和筛选。对照组中维生素K2、伞形花内酯降低(P＜0.05)，而治疗组中无明显变化(P＞0.05)。

5 讨论

本研究通过液相色谱质谱法探索分析了新辅助化疗的乳腺癌患者接受参芪扶正液治疗的治疗组与未接受参芪扶正液治疗的对照组血浆代谢组学的变化，结果发现，相比化疗前，经参芪扶正液干预的治疗组和对照组其代谢轮廓化疗后均发生了明显差异。共有13个代谢物出现了明显的变化，但2组化疗前后发生变化的程度不一致，其中，经参芪扶正液干预的患者，化疗后维生素K2与伞形花内酯的含量相比对照组可维持稳定，结合研究中35例患者新辅助化疗的临床疗效评估为参芪扶正液干预的治疗组略优于对照组[58.8%(10/17)VS 50.0%(9/18)]，笔者推论，维生素K2和伞形花内酯可能是参芪扶正液对化疗增效的重要代谢通路。伞形花内酯为家庭种当归类植物抗毒素，主要功能是营养补充，目前尚缺乏相关研究，以下就维生素K2与参芪扶正液对化疗增效的相关机制展开论述。

图2 血浆代谢组学数据分析

表3 化疗前后血浆差异代谢物鉴定

Vit K2主要作用是维持机体的正常凝血功能，临床上主要用于出血性疾病的治疗。但早在上世纪40年代末，有学者已发现接受维生素K治疗的肿瘤病人，其肿瘤出现坏死现象，由此推断维生素K可能具有抗肿瘤作用。近几年越来越多的研究发现，Vit K2对多种恶性肿瘤细胞有生长抑制作用，包括结肠癌、肺癌、乳腺癌细胞[2]，并可诱导肝细胞癌、卵巢癌等多种实体瘤和白血病、骨髓增生异常综合征的细胞凋亡，具有明显的抗肿瘤作用，且与多种抗肿瘤药有协同作用。Vit K2抗肿瘤疗效已在许多临床研究中得到验证，Vit K2及其衍生物对肝癌细胞有抑制作用，对肝癌术后复发和生存率也有一定的影响。如Xia J等[3]以PKC亚型特异性抑制剂或siRNA处理人肝癌 Huh7细胞，加入四烯甲萘醌(Vit K2类似物)，观察到VitK2可通过抑制TPA诱导的N-kappaB的活化来抑制癌细胞的生长。Ishizuka等[4]将101例HCC经根治术后患者随机分为Vit K2组和对照组，患者术前γ-脱羧基凝血酶原均正常，结果显示，对照组在12、24、36个月累积存活率分别为81.3%、0、0，而Vit K2组为78.3%、58.1%、31.0%，提示Vit K2对患者的生存有益。Vit K2还可诱导急性髓系白血病细胞系的凋亡和分化。Kitagawa等[5]将ACR(视黄醇)和Vit K2联合发现其呈剂量依赖性抑制HL-60细胞(人早幼粒细胞白血病细胞)的增殖。Wei-xing等[6]将人胃癌裸鼠随机分为对照组、Vit K2治疗组、贝那普利治疗组和联合治疗组(Vit K2+贝那普利)，发现联合治疗组的凋亡指数升高，抗肿瘤效果显著优于维生素K2组或贝那普利组。这都提示Vit K2具有明显的抗肿瘤作用。而关于Vit K2的抗肿瘤机制则说法较多，包括Vit K2参与线粒体电子信号的传递、影响Bcl-2蛋白、影响caspase家族诱导细胞凋亡、调节G1期相关的细胞周期分子的表达等[7]，但均存有争议，这些均很大程度上影响Vit K2的应用和研究。

Vit K2直接抗肿瘤的作用还需进一步研究验证，但近年来VK被证实可用于降低骨折风险，如在一项纳入55例患者的双盲研究中发现，平均每天摄入45 mg Vit K2的患者其血中羧化骨钙素含量明显高于对照组(安慰剂组)[8]。Cockayne S等[9]作了Meta分析，共包括775名患者，结果显示，MK4(VK2-4)可以明显降低骨折风险。这可能可以减少肿瘤骨转移病中的骨相关事件，甚至改善生存期。

维生素K2(Vit K2/MK，甲萘醌)来源于食物或由人体肠道菌群产生，严格来说，Vit K2不是一种必需的维生素，它可由人体肠道内正常定植的菌群利用维生素K1转化合成，主要来源于革兰阴性菌属，包括拟杆菌、丙酸杆菌以及乳酸菌等。一般来说，只有在特定人群才需要额外补充Vit K2，比如有特殊基因型、绝经后女性[10]、或患特殊代谢性疾病的人群等等。因此，如果因为疾病影响或药物干预导致肠道功能紊乱，将会一定程度上减少Vit K2的生成。化疗作为乳腺癌的重要治疗手段之一，它的治疗作用不仅表现在对肿瘤细胞的直接杀灭作用，同时也影响了肿瘤细胞赖以生存的机体内环境，其中，肠道生态环境即为内环境研究的重要方面，临床上常见消化道不良反应。肠道上皮组织是一种更新快的组织，平均3～5天就要更新一次，对化疗十分敏感。研究发现，化疗可通过直接损伤肠粘膜细胞、破坏肠粘膜免疫功能以及造成肠道菌群紊乱等多种机制损伤胃肠道，引起化疗不良反应，严重者可影响化疗的顺利进行，降低疗效[10]。

中医对肿瘤有“因虚致瘤”“扶正积自消”等见解，因此有“扶正抗瘤”一说。历代医家扶正尤重调补脾肾，扶正法的代表药物大多为健脾益肾之物，如黄芪、人参、淮山药等，此类健脾中药的抗肿瘤研究机制主要为调节消化道功能，增加胃肠酶的分泌(液淀粉酶、胰淀粉酶)，提高小肠吸收功能，促进RNA蛋自质的合成、促进肿瘤细胞坏死、凋亡等等。但这仅为单药分析阶段，尚不能解释扶正法复方如参芪扶正液的抗瘤机制。参芪扶正液主要成分是黄芪、党参，具有益气健脾之用。作为扶正法的代表，研究已表明参芪扶正液在降低毒副反应、改善生活质量的同时，亦可改善短期疗效。目前其“增效机制”尚不明确，本研究中治疗组化疗前后维生素K2含量无明显变化，提示参芪扶正液对肠道功能的保护，可能解释了扶正药物对化疗增效的机制，与中医所倡导的健脾“扶正抗瘤”理论相一致。

本研究尚存在许多不足之处，一是样本量不足，虽然治疗组和对照组的代谢物谱在化疗后发生的差异各不相同，2组临床疗效亦显示有参芪扶正液干预的治疗组略优于对照组，但差异不具有统计学意义，因此无法作代谢组学变化与疗效的相关性分析，目前仅限于探讨阶段；二是未设立健康组，文献报道提示乳腺癌患者本身与健康人的血清代谢组学存在差异，本研究所纳入均为乳腺癌患者，分为对照组和治疗组，结果两组化疗后的代谢组学差异仅表示参芪扶正液组与单纯化疗组之间存在差异，但却不能提示治疗组的代谢物谱是否更接近健康人；三是未详细评价治疗的不良反应，仅作疗效与代谢物改变的关系探讨，以上问题亟待进一步改进。

综上所述，根据本研究的代谢组学分析结果，重点围绕代谢物维生素K2与参芪扶正液对化疗“增效”对扶正法抗肿瘤的机制展开论述，提示扶正法可能是通过维持肠道环境稳态，进而保护机体抗肿瘤的有利因子Vit K2而实现抗瘤目的的，有待进一步的研究验证。代谢组学作为一门新兴学科，仍有很多问题亟待解决，但随着其技术的不断成熟和研究的深入，代谢组学可越来越多地发现肿瘤发生及转移过程中关键的代谢产物，为肿瘤的靶向治疗开辟了新思路，真正实现肿瘤个体化治疗。

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（责任编辑：刘淑婷）

R737.9

A

0256-7415（2016）12-0136-05

10.13457/j.cnki.jncm.2016.12.058

2016-08-20

广东省中医药管理局资助重点项目（2012年）；广东省中医药管理局资助项目（2013年）

林晓洁（1989-），女，医学硕士，住院医师，研究方向：中医药防治乳腺病。

司徒红林，E-mail：sthl666@163.com。