人脐带间充质干细胞对胶质瘤细胞株U87上皮间质转化及皮下荷瘤能力的影响

刘高米洋和法莲陈慧芬陆容李自安何洁赵晶潘兴华

·论著·

人脐带间充质干细胞对胶质瘤细胞株U87上皮间质转化及皮下荷瘤能力的影响

刘高米洋1和法莲2陈慧芬2陆容3李自安1何洁1赵晶1潘兴华1

目的 研究人脐带间充质干细胞（hUCMSCs）体外模型中对胶质瘤细胞株U87荷瘤能力及其上皮间质转化（EMT）的影响及其可能机制。方法 建立裸鼠皮下荷瘤模型，观察hUCMSCs与U87共培养组和U87单独荷瘤组皮下荷瘤能力的差别，免疫组化检测EMT相关基因组织表达水平，Western Blot检测EMT相关蛋白MMP2，MMP7,MMP9，E-cadherin（E-cad），N-cadherin（N-cad）和Vimentin（VIM）表达情况，qPCR检测EMT相关基因（mmp2，mmp7，mmp9，E-cad，N-cad和vimentin）转录水平。Transwell和Matrigel分别检测hUCMSCs对U87转移能力的影响，两组间比较拟采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。结果 皮下荷瘤结果提示hUCMSCs与U87共培养组皮下荷瘤率高于U87单独荷瘤组，且肿瘤体积较大，RT-PCR结果提示：共培养组和单独培养组相比，E-cad水平下调，N-cad和VIM上调，且基质金属蛋白酶家族MMP2，MMP7，MMP9也有不同程度上调。Western blot结果提示：在蛋白水平共培养组和单独培养组相比，E-cad水平下调2.1倍，N-cad和VIM上调1.0倍，MMP9上调0.9倍；E-cad，N-cad，VIM以及MMP2变化结果与RT-PCR结果一致。免疫组化结果进一步验证hUCMSCs能促进U87表达Ki67，E-cad与N-cad低表达。Transwell和Matrigel实验结果提示hUCMSCs能够促进U87细胞的转移侵袭能力。结论 hUCMSCs能通过促进U87高表达EMT相关基因和增殖相关基因Ki67，从而促进胶质瘤细胞株U87皮下肿瘤形成并发生上皮间质转化，提示hUCMSCs临床应用中应该充分考略受试者是否是潜在胶质瘤患者。

脐带； 间质干细胞； 胶质瘤； 生物转化

人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs）是目前研究最多、最具有应用前景的一类成体干细胞，被证明能够修复组织损伤，治疗某些难治性疾病。hUCMSCs和骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）及脂肪来源的MSCs相比具有其独特的优势：取材方便，环保，“废物”再利用，容易扩增。近年来，研究发现MSCs能够定向迁移到某些特定的肿瘤部位，一部分研究显示MSCs能够促进肿瘤的发生发展，但也有学者报道迁移到肿瘤部位的MSCs有抑制肿瘤生长的作用。hUCMSCs长期植入体内可能造成分化不良和潜在的肿瘤形成能力不明[1]，成为hUCMSCs临床转化应用的绊脚石。

脑胶质瘤是起源于脑部神经胶质细胞，是最常见的颅内肿瘤，约占所有颅内肿瘤的45％左右。在儿童恶性肿瘤中排第2位，近30年来，原发性恶性脑肿瘤发生率逐年递增，年增长率为1.2％，中老年人群尤为明显。据文献报道，中国脑胶质瘤年发病率为3 ～ 6人/10万人，年死亡人数达3万人[2]。胶质瘤系浸润性生长物，它和正常脑组织没有明显界限，难以完全切除，对放疗化疗不敏感，易复发，生长在大脑等重要部位的良、恶性肿瘤，手术难以切除或根本不能手术，化学药物和一般抗肿瘤的中药，因血脑屏障等因素的影响，疗效也不理想，因此脑胶质瘤至今仍是预后最差的肿瘤之一。

因此，本课题选取恶性胶质瘤细胞株U87为实验对象，通过裸鼠皮下荷瘤模型探索hUCMSCs在体内对胶质瘤细胞的影响，为hUCMSCs临床应用提供实验参考。

材料和方法

一、材料

1.主要试剂和器材：DMEM/F12培养基（美国Hyclone公司），胎牛血清（美国BI公司），双抗（美国BI公司），Trizol（美国Invitrigen公司），GoTag qPCR Master Mix（美国Promega公司），Anti-Ki67 antibody、Anti-E-cadherin antibody、Anti-N-cadherin antibody、anti-GAPDH antibody、兔anti Mouse IgG H＆amp;L（HRP）、羊 anti Rabbit IgG H＆amp;L（HRP）（美国Abcam公司），qPCR引物由thermo公司设计合成，牛血清白蛋白（美国Sigma公司），BCA蛋白定量试剂盒（美国Thermo fsher公司），百万层级层流超净工作台（SW-CL-2F型，苏州佳宝净化工程设备有限公司），细胞培养37℃的CO2孵箱（美国Thermo公司），电泳槽（美国Bio-rad公司），倒置相差显微镜（日本奥林巴斯公司），多功能酶标仪（美国Biotc公司），Matrigel Invasion Chamber（BD公司），Transwell Chamber（美国Costar公司），免疫组化石蜡包埋机（德国Leica公司），免疫组化切片机（德国Leica公司），半干转膜仪（美国Thermo公司），荧光实时定量PCR仪（美国Bio-rad公司）。

2.细胞株和实验动物：U87购自昆明动物所，hUCMSCs来自本实验室分离培养的剖腹产脐带3 ～ 5代MSCs，4 ～ 5周龄雄性BALB/C nude mouse购自北京维通利华公司。

二、方法

1. hUCMSCs分离和培养：在征得产妇及其家属知情同意并且通过医院伦理委员会批准情况下，取本院足月剖腹产新生儿脐带，经检测产妇无传染性疾病，胎儿无先天性疾病和畸形。无菌条件下，将采集的脐带用生理盐水反复冲洗，去掉残留血液。将脐带剪碎为1 mm3组织块，转移到培养瓶中，用含20％FBS的DMEM/F12培养基培养，次日补液，3 d后换液，7 d后观察细胞生长状态，达到80％融合后传代培养。

2.皮下荷瘤模型：采用对数生长期U87和第3代hUCMSCs，分别制成单细胞悬液，计数细胞密度，用生理盐水调节细胞密度为1×107/ml，对照组裸鼠右后股处皮下注射U87细胞悬液200 μl共2× 106个细胞，实验组按照U87：hUCMSCs = 10∶1的比例混合制备成U87-hUCMSCs细胞混合液后裸鼠右后股处皮下注射200 μl细胞悬液，细胞总数为2× 106个。每隔1周测量裸鼠皮下肿瘤长径和短径，1个月后处死裸鼠剥离肿瘤。拍照后浸泡在福尔马林中备用。测量肿瘤长径a和短径b，按照V = 0.5× ab2计算肿瘤体积，进行统计学分析

3.免疫组化染色：将皮下荷瘤实验中获得的肿瘤标本进行石蜡包埋后切片，厚度2 μm，石蜡切片60℃烤箱过夜，切片脱蜡至水，3％过氧化氢甲醇液中室温浸泡20 min，双蒸水洗5 min 3次，抗原修复后自然冷却至室温，双蒸水洗5 min 3次，1％ BSA 37℃封闭30 min，甩去封闭液，直接加一抗。置于湿盒中37℃孵育30 min，然后4℃冰箱过夜（16 h），4℃冰箱中取出，室温复温15 min，用0.01 mol/L PBS 洗5 min 4次，滴加DAKO二抗，37℃孵育45 min，用0.01 mol/L PBS 洗5 min 4次，DAB显色，镜下观察，双蒸水终止显色，苏木素复染10 s，分化后自来水反蓝，盖玻片覆盖，显微镜下观察阳性显色，拍照。

4.转移侵袭能力检测：（1）transwell实验：于24孔板中分别种入0，1.0×104，2.0×104，3.0×104个第5代对数生长期hUCMSCs，无血清培养12 h后在8 μm Transwell Chamber中种入无血清培养的1.5×104个U87，将小室轻轻放入已种入MSCs的24孔板中，24 h后去除小室和24孔板中培养基，生理盐水洗2次，风干片刻，4％甲醛固定30 min，去除甲醛，生理盐水洗3次，风干片刻，结晶紫染色30 min，拍照并计数细胞。（2）Matrigel实验：于24孔板中分别种入0，1.0×104，2.0×104，3.0×104个第五代对数生长期hUCMSCs，无血清培养12 h后在8 μm Matrigel Chamber中种入无血清培养的4.5× 104个U87，将小室轻轻放入已种入MSCs的24孔板中，24 h后去除小室和24孔板中培养基，生理盐水洗2次，风干片刻，4％甲醛固定30 min，去除甲醛，生理盐水洗3次，风干片刻，结晶紫染色30 min，拍照并计数细胞。

三、统计学分析方法

采用Graphpad统计软件进行统计学分析，皮下荷瘤肿瘤体积统计结果采用± s表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P ＜ 0.05为差异具有统计学意义。

结 果

一、hUCMSCs的分离培养

原代hUCMSCs培养24 h后可见少量细胞（细胞计数为68 ～ 85/mm3）贴壁生长（图1a），2 d后可见较多细胞爬出（图1b），传到第3代后细胞转移时呈纤维样（图1c），稠密呈漩涡状生长（图1d），达到100％融合时T175细胞培养瓶细胞计数平均为每瓶1.5×107个。

二、hUCMSCs可促进U87的裸鼠皮下成瘤能力

本研究建立了裸鼠皮下荷瘤模型，实验组将U87和hUCMSCs按照10 ∶1比例混合，对照组为等数目的U87细胞悬液，每周观测瘤直径，1个月后脱臼法处死裸鼠，剥离肿瘤，实验结果显示：hUCMSCs共培养组肿瘤体积平均值为（29.46± 5.64）mm3，U87组肿瘤体积平均值为（6.77± 1.57）mm3，hUCMSCs共培养组较U87组瘤体积更大（P = 0.0033），差异具有统计学意义（图2）。

三、hUCMSCs诱导U87的EMT特性

将皮下荷瘤模型所得标本进行HE染色（图3），结果提示hUCMSCs接触式共培养组细胞排列无序无序，细胞核浆比升高，提示其恶性程度更高。免疫组织化学检测增殖指标Ki67和EMT标志物E-cad和N-cad，结果提示（图4）hUCMSCs共培养组Ki67和E-cad强染色，而N-cad弱染色，U87单独培养组Ki67和E-cadherin弱染色、N-cadherin强染色。提示组织层面，hUCMSCs接触式共培养条件下U87增殖能力增强并且可能通过EMT促进肿瘤转移。

本研究利用qPCR和Westernblot检测EMT相关基因mRNA和蛋白水平，结果（图5）显示，共培养组EMT标志物E-cad，N-cad和twist1均上调，基质金属蛋白酶家族中mmp2，mmp7和mmp9也明显上调，差异具有统计学意义。Western blot检测E-cad、N-cad和mmp9蛋白水平，结果显示（图6）共培养组E-cad下调，N-cad和mmp9上调，提示hUCMSCs促进U87发生上皮间质转化。

四、hUCMSCs促进U87转移侵袭

为进一步明确hUCMSCs对U87转移能力的影响，本研究利用Transwell和Matrigel法建立非接触式共培养体系。结果显示：hUCMSCs在非接触条件下能够促进U87转移（图7）和侵袭（图8）；Transwell实验中，100倍视野下，hUCMSCs组穿过小室细胞计数平均值为312个细胞，U87组细胞计数平均值为109个细胞（P ＜ 0.01），差异具有统计学意义；在Matrigel实验中，100倍视野下，hUCMSCs组穿过小室细胞计数平均值为256个细胞，U87组细胞计数平均值为102个细胞（P = 0.015），差异具有统计学意义。

图1 倒置显微镜下观察脐带间充质干细胞的生长形态 （×40）

图2 皮下荷瘤实验检测接触式共培养MSC对U87细胞成瘤能力的影响

图3 倒置显微镜下观察裸鼠皮下荷瘤 （HE染色×40）

图4 倒置显微镜下观察裸鼠皮下荷瘤免疫组化结果 （×40）

图5 qPCR检测EMT相关分子转录水平

讨 论

图6 Western blot检测结果

MSCs具有强大的自我复制能力和多向分化潜能，在特定条件下可以分化形成多种功能细胞，是生物体保持形态与功能正常的重要基础，参与生物体生长、发育和损伤修复等多种生物学过程。MSCs来源广泛、取材方便，同时具有造血支持和免疫调节功能，这使其成为有前途的临床使用种子细胞。成体骨髓来源MSCs和hUCMSCs是研究最多最早的两种MSCs，但由于其取材具有较强侵袭性，细胞的数量、增殖和分化能力随供者年龄增长而显著下降，容易被病毒感染，这些因素限制了骨髓MSCs的应用。和骨髓MSCs相比，hUCMSCs有较易取材、无伦理争议、生物学性能更加稳定、无异体排斥等优点因此是细胞治疗和细胞工程首选的种子细胞[3]。尽管如此，hUCMSCs的临床转化依然存在很多问题，首当其冲的就是长期移植后的安全性问题，包括其分化特征和潜在的肿瘤形成及促进能力[4-7]，因此明确hUCMSCs在体内与肿瘤细胞，尤其是恶性肿瘤细胞的相互作用是hUCMSCs临床转化的必经之路，本课题选取了易复发、放化疗均不敏感的恶性胶质瘤细胞株U87作为实验对象，研究hUCMSCs在体内状况下能否促进U87的恶性转化能力，为hUCMSCs的临床应用提供数据支持，进一步明确hUCMSCs的安全性问题。

图7 倒置显微镜下观察穿过transwell小室U87及小室外hUCMSC形态 （结晶紫染色 ×40 ）

图8 倒置显微镜下观察穿过Matrigel小室U87及小室外hUCMSC形态 （结晶紫染色 ×40）

恶性胶质瘤具有高生长率、高侵袭性、预后差、发现较晚，复发率较高，放化疗不敏感的特点。胶质瘤患者术后肿瘤细胞残余被认为是复发的主要原因，因此这类型患者可能处于影像学不明的携瘤状态。“种子-土壤”学说[8]提示体外细胞模型不能完全代表体内的实际情况，因此，本研究采用体内模型直接观察接触式肿瘤细胞和hUCMSCs相互作用的结果。通过建立裸鼠皮下荷瘤模型，结果显示hUCMSCs共培养组较U87组瘤体积更大并且在肿瘤剥离的过程中，观察到共培养组的肿瘤血管生成明显增加，提示hUCMSCs可能促进肿瘤的转移。HE的结果显示共培养组细胞核异形程度更多，细胞排列不规律，核浆比显著升高，说明hUCMSCs共培养组U87细胞形成的皮下肿瘤恶性程度较高。EMT与肿瘤的转移密切相关，是肿瘤恶性生物学行为的重要方面，因此，免疫组化中检测了EMT的标志性分子E-cadherin和N-cadherin[9]，结果hUCMSCs抑制U87的EMT相关的E-cad表达，促进N-cad表达，提示hUCMSCs可能通过促进U87的EMT转化进一步促进U87的转移和侵袭。Ki67是细胞增殖的标志性蛋白，检测Ki67显示hUCMSCs共培养组Ki67染色较强，提示hUCMSCs具有促进U87增殖的作用。研究表明hUCMSCs能够分泌抑滤泡素样蛋白（PSTL1）通过调节增殖和分化有关生长因子发挥作用；胰岛素样生长因子结合蛋白3、4、5（IGFBP3，4，5）通过延长IGF的半衰期促进细胞生长；转化生长因子β结合蛋白2（LTBP1）是TGF-β1前体复合物的一部分；硫酸软骨素蛋白聚糖2（CSPG2）与聚合蛋白（AGRIN）参与了细胞生长与分化调节[10]。因此hUCMSCs可能是通过旁分泌作用，分泌多种蛋白活性成分从而促进肿瘤细胞的增殖和EMT。Western Blot和qPCR实验结果分别从蛋白水平和RNA水平进一步验证了上述实验结果。Transwell和Matrigel法分别模拟了肿瘤细胞转移和突破基底膜的过程进一步证明了上述推论。

本课题研究表明，hUCMSCs在裸鼠皮下荷瘤模型中能够促进U87细胞的成瘤能力且有促转移的可能性，因此，临床应用hUCMSCs治疗神经性损伤类疾病时有必要考虑hUCMSCs对潜在的胶质瘤细胞的促瘤作用。

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Effects of human umbilical cord mesenchymal stem cell on epithelial-mesenchymal transition and growth of Glioma cell line U87

Liu Gaomiyang1, He Falian2,Chen Huifeng2, Lu Rong3, Li Zi'an1, He Jie1, Zhao Jing1, Pan Xinghua1.1Cell Biological Therapy Center of Kunming General Hospital, Chengdu Military Region of Chinese People‘s Army; Cell Biological Medicine Integrated Engineering Laboratory of State and Region of Yunnan Province, Kunming 650032, China;2Kunming General Hospital Clinical Collage of Kunming Medical University ,Kunming 650032, China;3Shanghai Children's Hospital, Shanghai 200062, China

Pan Xinghua, Email: panxinghua@aliyun.com

Objective To study the effects of human umbilical cord mesenchymal stem cells（hUCMSCs）on growth of human glioma cell line U87 in vitro and epithelial-mesenchymal transition and its possible mechanism. Method The subcutaneous growth of U87 tumor in nude mice was compared between the U87 cells co-cultured with hUCMSCs and U87 cultured alone. The expression of EMT related genes was evaluated with immunohistochemistry. Expression of E-cad, N-cad andMMP9 was evaluated with Western blot for cultrued cells. RT-PCR was used to detect mRNA levels of EMT-associated gene. Using transwell and matrigel methods, the invasion and migration ability of U87 was evaluated. Independent sample t-test and ANOVA were used for comparison of data, which were expressed as mean ± standard deviation. Results IMore subcutaneous tumor was seen in nude mice inoculated with U87 cells co-cultured with hUCMSCs than U87 cells cultured alone, with upregulated expression of E-cadherin, mmp2, mmp7,and mmp9 and down-regulated expression of N-cad. Western blot showed the same results in E-cadherin,N-cadherin, vimentin and MMP2 changes with RT-PCR. Transwell and Matrigel results showed the migration and invasion of U87 was promoted by hUCMSCs. Conclusion hUCMSCs can promot EMT and proliferation of U87, suggesting that the potential tumor-promoting effects of hUCMSCs should be fully considered in clinical application of hUCMSC.

Umbilical Cord; Mesenchymal Stem Cells; Glioma; Biotransformation

2016-08-10）

（本文编辑：陈媛媛）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2016.06.008

国家自然科学基金（No.81170316）

650032 昆明，成都军区昆明总医院细胞生物治疗中心，干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合实验室，云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室1；650032 昆明医科大学成都军区昆明总医院临床学院2；200062 上海市儿童医院中医科3

潘兴华，Email∶ panxinghua@aliyun.com

前两位作者对本文具有相同贡献，同为第一作者

刘高米洋，和法莲，陈慧芬，等.人脐带间充质干细胞对胶质瘤细胞株U87上皮间质转化及皮下荷瘤能力的影响[J/CD].中华细胞与干细胞杂志∶电子版, 2016, 6(6)∶369-375.