不同途径移植脐带血干细胞对兔2型糖尿病的疗效观察

丁海霞 王富军 黄晓伟 刘贝 杜亚萍 齐会卿

·论著·

不同途径移植脐带血干细胞对兔2型糖尿病的疗效观察

丁海霞 王富军 黄晓伟 刘贝 杜亚萍 齐会卿

目的 观察不同途径移植脐带血干细胞对兔2型糖尿病的治疗效果。方法 30只新西兰白兔，雌雄各半，制备2型糖尿病模型，随机分成5组，其中6只在兔的胰腺内注射脐带血干细胞5×105个（A组），6只向胰腺背动脉内注入脐带血干细胞5×105个（B组），6只经耳缘静脉输注脐带血干细胞5×105个（C组），6只在腹腔内多处注入脐带血干细胞5×105个（D组），其余6只向腹腔内注射相同体积的PBS液作为对照组（E组）。HE染色观察胰腺组织形态学变化。以上5组白兔均培养观察4周，每天监测白兔血糖，每周测血浆胰岛素水平，采用单因素方差分析和t检验对血糖值及胰岛素水平进行统计分析。结果 A组及B组在移植后血糖逐渐下降，胰岛素水平逐渐上升，第4周末，血糖降至（6.80±0.64）mmol/L和（6.78±0.57）mmol/L，胰岛素水平逐渐回到正常分别为（25.60±1.47）mU/L和（25.55±1.52）mU/L，与E组（21.77±2.70）mmol/L和（3.80±0.41）mU/L比较，差异均有统计学意义（P ＜ 0.01）。而C组血糖较前下降，至第4周末血糖及胰岛素均未回正常水平，分别为（9.97±1.19）mmol/L和（15.82±1.05）mU/L，D组仍维持高血糖状态，血糖水平为（21.00±1.99）mmol/L，胰岛素水平无明显变化（3.77±0.31）mU/L，与E组（21.77±2.70）mmol/L和（3.80±0.41）mU/L比较，差异无统计学意义（P ＞ 0.05）。移植后4周A、B两组胰腺组织形态得到明显改善，C组部分改善，D组无明显改善。结论 将脐带血干细胞在胰腺、胰腺背动脉注射及耳缘静脉输注进行移植，可以明显降低血糖，增加胰岛素分泌量，其中，胰腺和胰腺背动脉注射效果优于耳缘静脉输注，腹腔内移植无明显效果。

脐血干细胞移植； 糖尿病，2型； 治疗结果

近年来，糖尿病的发病率逐年增加，需要长期口服药物或注射胰岛素控制血糖，而人脐带血干细胞因其可分化为胰岛β细胞分泌胰岛素[1]使得其在糖尿病治疗中的效果备受关注，目前已有25 000多例临床移植成功的案例[2]。与骨髓干细胞和外周血干细胞相比，脐带血干细胞具有来源广泛、免疫源性低、增殖能力强等特点[3-4]，因此已广泛应用于临床治疗糖尿病、神经系统疾病、血液系统疾病、消化系统疾病、自身免疫性疾病及其它少见疾病，均取得了良好的治疗效果[5]。

目前临床上脐带血干细胞移植途径主要有静脉输注、胰腺背动脉注射或两种方法联合移植，而腹腔注射、胰腺实质注射目前临床尚无应用，究竟哪种移植途径效果更好，文献少有报道。徐谷根等[6]报道了脐带血干细胞胰腺实质及胰腺背动脉注射的效果比较，但缺乏静脉输注法的效果观察。

本文对上述不同移植方法进行了疗效对比，试图寻找一种简便、经济、高效的移植方法，为临床脐带血干细胞移植治疗糖尿病提供理论依据。

材料与方法

一、材料及试剂

4周龄新西兰健康大白兔30只（雌雄各半，河北医科大学动物实验中心提供），体质量（2.3± 0.5）kg。淋巴细胞分离液由天津颢阳公司（密度为1.077 g/m1）提供，血糖测定试剂盒由保定长城临床试剂公司提供，血糖监测采用罗氏血糖仪，胰岛素ELISA试剂盒由Mercodia公司提供，苏木素一伊红购自北京中杉金桥公司。

二、研究方法

1.人脐带血干细胞混悬液的制备：脐血由石家庄市妇产医院提供，来源于足月分娩的健康产妇，乙肝、艾滋、梅毒等检测均呈阴性，产妇及其家属均签署知情同意书，实验方案经医院医学伦理委员会批准。取新鲜脐血（6 h内用毕），用PBS液（phosphate buffer solution，磷酸盐缓冲液，Nacl 8 g，Na2HPO41.44 g，Kcl 0.2 g，KH2PO40.24 g，溶于1 000 ml去离子水中，高压灭菌，保存于4℃的冰箱备用，pH值7.40）等倍稀释后置于50 ml离心管中，按1∶1比例加入人淋巴细胞分离液上，4℃，离心半径5 cm，2 000 r/min，离心20 min后，脐血分5层，中间白膜层即为单个核细胞。用移液器小心吸取富含单个核细胞的混悬液放入另一离心管内，4℃，离心半径5 cm，1 000 r/min离心15 min，PBS洗涤3次。用低糖DMEM培养液悬浮，计数细胞浓度为5× 105/ml。人脐带血干细胞混悬液制备成功。

2.兔2型糖尿病模型的制备：30只新西兰白兔基础饲料适应性喂养1周，给予高脂高糖饲料喂养，高脂高糖饲料配方：37％蔗糖、5％猪油、53％基础饲料。第9周所有动物禁食16 h（不禁水），经耳缘静脉1次快速注射链脲佐菌素[（streptozocin，STZ）Sigma公司]，与0.1 mmol/L、pH值4.2的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配制成浓度为2％的STZ溶液）60 mg/kg，于STZ造模后第1周、第2周分别空腹采血1次。采血后及时分离血清，测定空腹血糖，以空腹血糖≥11.0 mmol/L为2型糖尿病造模成功。

3.脐带血干细胞移植术：30只2型糖尿病白兔随机分成5组，其中6只在兔的胰腺内注射脐带血干细胞悬液1 ml，浓度为5×105个/ml（A组），6只向胰腺背动脉内注入脐带血干细胞悬液1 ml，浓度为5×105个/ml（B组），6只经耳缘静脉输注脐带血干细胞悬液1 ml，浓度为5×105个/ml（C组），6只在腹腔内多处注入脐带血干细胞悬液1 ml，浓度为5×105个/ml（D组），其余6只向腹腔内注射相同体积的PBS液作为对照组（E组）。以上5组白兔均培养观察4周，每天监测白兔血糖，每周测血浆胰岛素水平，采血及血糖监测时间均为夜间空腹10 h后次日晨8点。

4.组织形态学观察：采血结束后将白兔处死留取胰腺组织，经固定、冲洗、脱水、浸染、包埋、切片，行HE染色，光镜下观察各组白兔胰腺组织形态。

三、统计学分析方法

应用SPSS 13.0统计学软件分析，血糖和胰岛素水平用± s描述，组间比较采用单因素方差分析，组内治疗前后比较采用配对t检验。以P ＜ 0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、各组白兔移植前后血糖及胰岛素水平的动态比较

A组及B组在移植后血糖逐渐下降，胰岛素水平逐渐上升，第4周末，血糖和胰岛素水平逐渐降到正常，与E组比较，差异均有统计学意义（P ＜0.01）。而C组血糖较前下降，胰岛素水平较前升高，但至第4周末血糖及胰岛素均未回复正常水平，D组仍维持高血糖状态，血糖和胰岛素水平较前无明显变化，与E组比较，差异无统计学意义（P ＞ 0.05，表1、2）。

二、各组白兔移植后4周胰腺组织HE染色形态比较

分组治疗4周后取白兔胰腺组织显微镜下观察发现，A组及B组胰腺组织形态较清晰，结构比较完整，较多的胰岛细胞团，无明显淋巴细胞浸润；C组与上述两组比较形态偏紊乱，较少的淋巴细胞浸润；D组与E组比较形态无明显差异，可见胰腺组织胰岛结构萎缩，形态紊乱，仅见少许胰岛细胞团，并伴淋巴细胞浸润（图1）。

讨 论

表1 移植前后各组白兔血糖水平的变化（n = 6，mmol/L，± s）

表1 移植前后各组白兔血糖水平的变化（n = 6，mmol/L，± s）

注：A组为胰腺内注射组,B组为胰腺背动脉注射组,C组为耳缘静脉输注组,D组为腹腔注射组,E组为对照组。与A组相比aP ＜ 0.01，与B组相比bP ＜ 0.01, 与C组相比cP ＜ 0.01，与D组相比dP ＜ 0.01

分组移植前移植后1周移植后4周F值P值A组21.73±1.65 11.45±1.97 6.80±0.64 149.953＜ 0.01 B组21.55±1.78 11.50±1.88 6.78±0.57 145.181＜ 0.01 C组21.43±2.16 14.02±1.13abd9.97±1.19abd82.488＜ 0.01 D组21.03±2.01 21.03±2.03abc21.00±1.99abc0.001＞ 0.05 E组21.72±2.76 21.72±2.75abc21.77±2.70abc0.001＞ 0.05 F值 0.110 37.861 127.289 P值0.978 0.000 0.000

表2 移植前后各组白兔胰岛素水平的变化（n = 6，mU/L，± s）

表2 移植前后各组白兔胰岛素水平的变化（n = 6，mU/L，± s）

注：A组为胰腺内注射组,B组为胰腺背动脉注射组,C组为耳缘静脉输注组,D组为腹腔注射组,E组为对照组。与A组相比aP ＜ 0.01，与B组相比bP ＜ 0.01，与C组相比cP ＜ 0.01，与D组相比dP ＜ 0.01

分组移植前移植后1周移植后4周F值P值A 组3.67±0.41 18.02±1.92 25.60±1.47 372.478＜ 0.01 B组3.65±0.39 18.12±1.94 25.55±1.52 357.783＜ 0.01 C组3.77±0.33 10.96±1.28abd15.82±1.05abd232.092＜ 0.01 D组3.83±0.36 3.83±0.34abc3.77±0.31abc0.078＞ 0.05 E组3.70±0.39 3.76±0.34abc3.80±0.41abc0.107＞ 0.05 F值0.241 163.669 613.361 P值0.912 0.000 0.000

脐带血是指胎儿娩出后残留在脐带和胎盘中的血液。新生儿脐带血中含有丰富的造血干细胞，研究发现，脐带血干细胞可以促进1型糖尿病卒中小鼠神经功能的恢复[7]，移植后小鼠胰岛中有10％ ～20％的胰岛素阳性细胞可检测出造血干细胞标志物，说明造血干细胞与胰岛β细胞再生存在密切的关系[8]。而糖尿病是由于患者体内胰岛素缺乏所致，因此有学者利用脐带血干细胞移植来治疗糖尿病，取得了不错的疗效[9-10]，移植脐带血干细胞治疗2型糖尿病的机制可能有如下几种：（1）使脐带血干细胞到达胰腺微环境，受到定向的诱导从而分化为胰岛β细胞，增加其数量，最大限度的恢复和挽救胰岛功能；（2）改善胰岛微环境，促进胰岛细胞的再生；（3）使糖尿病并发症得到有效改善和控制[11]，陈频等[12]的研究显示脐带间充质干细胞多次足量序贯输注干预模式对2型糖尿病大鼠糖代谢和胰岛分泌功能具有良好的改善作用，其机制可能与其下调TLR4/NF-kB炎症通路抑制胰岛β细胞凋亡有关，进一步研究发现干细胞抑制胰岛β细胞凋亡的作用更胜于其促进胰岛β细胞增殖[13]，但文献报道移植途径各有不同，缺乏对不同移植途径的对比，因此寻找一种方便快速、创伤小、效果好的方法成为众多医生奋斗的目标。

本研究采用兔制作糖尿病模型，因为兔是一种体型适中的动物，在给药、取血、抗病性等方面明显优于大鼠，便于开展糖尿病病理、治疗及相关研究。而高脂高糖喂养加注射小剂量STZ能复制出具有胰岛素抵抗、高血糖、高血脂等接近2型糖尿病临床特点的兔动物模型[14]，利于后续试验的开展。

在本研究中发现胰腺内注射组及胰腺背动脉注射组在移植后血糖逐渐下降，胰岛素水平逐渐上升，第4周末，血糖和胰岛素水平逐渐降到正常。而经耳缘静脉输注组血糖较前下降，胰岛素水平较前升高，但至第4周末血糖及胰岛素均未回复正常水平，经腹腔注射组仍维持高血糖状态，血糖和胰岛素水平较前无明显变化，上述结果提示，静脉输注有效，与胰岛及胰腺背动脉局部应用相比效果较差，这与白兔胰腺组织HE染色结果相一致，如果延长观察时间或者多次输注或者与胰岛局部注射联合效果可能更好，但尚待进一步研究。试验中应用的有效量为5×105个，在今后的研究中将对不同剂量干细胞注射效果进行对比观察。

综上所述，本文对比了脐带血干细胞不同移植途径对白兔糖尿病的治疗作用，胰腺注射及胰腺背动脉注射效果最佳，但若应用于人创伤大、费用高，而静脉注射法简单、有效，可通过多次注射、延长治疗时间增强治疗效果，腹腔内注射无明显效果，为临床脐带血干细胞移植提供了理论依据。

图1 光学显微镜下观察各组白兔移植后4周胰腺组织形态 （HE染色×200）

1 孙晓晖, 王颜刚. 干细胞移植定向分化为胰岛β细胞治疗糖尿病[J].中国组织工程研究与临床康复, 2009, 13(1)∶165-168.

2 Butler MG, Menitove JE. Umbilical cord blood banking∶ an update[J]. J Assist Reprod Genet, 2011, 28(8)∶669-676.

3 Lu DP, Wu T, Zao ZY, et al. Signifcantly reduce acute graft-versushost disease in haploidentical stem cell taansplantation by using cord blood as the third party cell[J]. Blood, 2008, 112(11)∶771.

4 Pittenger MF, Mackay AM, Jaiswal SC, et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells[J]. Science, 1999, 284(2)∶143-147.

5 黄志行, 田春芳. 脐带血的研究现状及其临床应用进展[J]. 医学综述, 2015, 21(8)∶1375-1377.

6 徐谷根, 肖毅, 尹卓娜, 等.不同部位脐血干细胞移植治疗糖尿病大鼠的效果研究[J/CD].中华临床医师杂志∶电子版, 2015, 9(13)∶134-136.

7 Yan T, Venkat P, Ye X, et al. HUCBCs increase angiopoietin 1 and induce neurorestorative effects after stroke in T1DM rats[J]. CNS Neurosci Ther, 2014, 20(10)∶935-944.

8 王海澜, 龙爱梅, 马真, 等. 大鼠骨髓间充质干细胞与大鼠胰腺岛管上皮细胞间接共培养向胰岛细胞分化的实验研究[J]. 实用医技杂志, 2010, 17(3)∶200-202.

9 张丽欣, 孙丽芳, 邢利和. 脐血干细胞移植治疗1型糖尿病的研究进展[J]. 临床合理用药杂志, 2011, 13(28)∶125-128.

10 迟作华, 陆琰, 张洹. 体外诱导脐血间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的初步研究[J]. 中国细胞生物学学报, 2008, 30(3)∶383-386.

11 徐谷根, 杨茵, 尹卓娜, 等. 脐带血干细胞移植治疗2型糖尿病临床分析[J]. 中国医药科学, 2011, 1(22)∶22-25.

12 陈频, 黄山, 徐向进, 等. 脐带间充质干细胞不同模式干预对2型糖尿病大鼠胰岛细胞凋亡的作用比较[J/CD].中华细胞与干细胞杂志∶电子版, 2016, 6(1)∶36-41.

13 Yanai G, Hayashi T, Zhi Q, et al. Electrofusion of mesenchymal stem cells and islet cells for diabetes therapy∶ a rat model[J]. PLoS One, 2013, 8(5)∶e64499.

14 燕娟, 郭巍伟, 梁执群, 等. 2型糖尿病大鼠模型的建立及其验证[J].临床和实验医学杂志, 2009, 8(4)∶5-6.

Effects of different route of umbilical cord blood stem cells transplantation in treatment of rabbits with type 2 diabetes mellitus

Ding Haixia, Wang Fujun, Huang Xiaowei, Liu Bei, Du Yaping, Qi Huiqing. Department of Endocrinology, the Fourth Affiliated Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050011, China

Wang Fujun, Email:wangfujun139@126.com

Objective To evaluate the therapeutic effects of different routes of umbilical cord blood stem cell (UCSCs) transplantation on type 2 diabetes mellitus in rabbits. Methods Thirty New Zealand white rabbits with type 2 diabetes were randomly divided into five groups. In the treatment groups, 5×105UCSCs were given via different routes∶ in pancreas in Group A, via dorsal pancreatic artery in Group B, via ear marginal vein in Group C, and in abdominal cavity in Group D. In Group E, the same volume of PBS was given via intraperitoneal injectionf ana served as control. The five groups were evaluated for 4 weeks, and the blood glucose was monitored every day, plasma insulin levels were measured every week. Pancreatic tissues were evaluated. Results In Group A and Group B, the blood glucose levels were decreased gradually, and the levels of insulin increased gradually, they returned to normal in the fourth week, as（6.80±0.64）mmol/L and (6.78±0.57)mmol/L, (25.60±1.47) mU/L and (25.55±1.52) mU/L, compared with the control group (21.77±2.70) mmol/L and (3.80±0.41) mU/L (P ＜ 0.01). The blood glucose and insulin levels were changed in Group C,and the levels of bood glucose and insulin were not returned to normal level at fourth weeks, the number were(9.97±1.19) mmol/L and (15.82±1.05) mU/L. The blood glucose level and insulin level were not significantly changed in Group D and Group E(P ＞ 0.05). The islet architecture was improved and cell unite numbers were significantly increased in A and B group, but no changes were fond in D group. Conclusions Transplantation of umbilical cord blood stem cells in the pancreas, pancreatic dorsal artery and ear vein infusion can significantly reduce blood glucose, increase insulin secretion, better than the abdominal cavity transplantation.

Umbilical cord blood stem cell； Transplantation； Diabetes mellitus, Type 2 ； Treatment outcome

2016-06-15）

（本文编辑：陈媛媛）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2016.06.002

河北省卫生厅课题（20150760）

050011 石家庄，河北医科大学第四医院内分泌科

王富军，Email：wangfujun139@126.com

丁海霞，王富军，黄晓伟，等. 脐带血干细胞不同途径移植对兔2型糖尿病的疗效观察[J/CD].中华细胞与干细胞杂志∶电子版, 2016, 6(6)∶334-338.