基质固相分散-共振光散射法测定蔬果中的甲基毒死蜱

张传林，胡庆红(遵义医学院 药学院，贵州 遵义 563003)

基质固相分散-共振光散射法测定蔬果中的甲基毒死蜱

张传林，胡庆红*
(遵义医学院 药学院，贵州 遵义 563003)

建立测定蔬果中甲基毒死蜱残留量的基质固相分散-共振光散射新方法,为蔬果中甲基毒死蜱的快速检测提供技术支持。以曲拉通X-100为稳定剂，甲基毒死蜱与灿烂甲酚蓝在pH值为10.00的Britton-Robinson缓冲液中相互作用，使体系共振光散射强度显著增强，并在360 nm、544 nm处出现特征散射峰。甲基毒死蜱质量浓度在0.1～5.0 μg/mL与544 nm处的散射强度有良好的线性关系，其检出限为0.029 μg/mL。各样品经基质固相分散法处理后，测得甲基毒死蜱的平均回收率为91.5%～96.8%。该方法快速、灵敏，可用于蔬果中甲基毒死蜱的检测。

共振光散射； 甲基毒死蜱； 灿烂甲酚蓝； 基质固相分散

甲基毒死蜱是一种广谱、高效的有机磷酸酯类杀虫剂，广泛应用于农业生产和卫生杀虫。但其在体内蓄积能引起一系列的中毒反应[1]。我国在最新实施的《食品中农药最大残留限量》中，将多种食品中甲基毒死蜱的残留限量暂定为5 mg/kg[2]。目前，检测样品中甲基毒死蜱残留的前处理方法主要为固相萃取法[3]，检测方法主要有高效液相色谱法[4]、气相色谱法[5]、色谱-质谱联用[6-8]等。现代食品安全需要发展更加快速、灵敏的检测技术。基质固相分散法是近些年发展起来的一种新型的样品前处理技术，其以固相萃取填料为分散剂，将样品与适量的分散剂充分研磨，制成均相装入小柱后选择合适的有机溶剂洗脱，除去基质中的杂质，同时完成对样品待测组分的提取和净化[9]。共振光散射法是近些年来发展起来的一种操作简便、分析快速、灵敏度可达纳克级的光谱新技术，在蛋白质[10]、核酸[11-12]、免疫[13]、药物[14-16]、无机离子[17]等分析领域得到了广泛应用。本研究利用基质固相分散法作为样品前处理手段，通过研究甲基毒死蜱与灿烂甲酚蓝相互作用产生的共振光散射光谱，建立了蔬果中甲基毒死蜱残留量的检测方法，以期为蔬果中甲基毒死蜱的快速检测提供技术支持，同时拓展共振光散射技术在分析领域的应用。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

蔬果样品购于遵义市某超市；甲基毒死蜱标准品购自德国Dr.Ehrenstorfer公司；灿烂甲酚蓝为分析纯，购自湘中精细化学品厂；丙酮、二氯甲烷、无水硫酸镁均为分析纯，曲拉通X-100、弗罗里硅土为化学纯，均购自国药集团化学试剂有限公司。无水硫酸镁、弗罗里硅土在650 ℃马弗炉烘烤5 h，弗罗里硅土用3%的水脱活后贮存于密封干燥器中备用。用酸度计测定配制一系列不同pH值的Britton-Robinson(B-R)缓冲溶液。

仪器包括VARIAN Cary Eclipse 荧光分光光度计(美国瓦里安公司)、TU-1901双光束紫外可见光分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)、90Plus PALS高灵敏度Zeta电位及粒度分析仪(美国布鲁克海文仪器公司)。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制 精密称取甲基毒死蜱标准品0.020 0 g，用丙酮定容于100 mL的容量瓶中，配成200 μg/mL的储备液，4 ℃保存，临用时用水稀释到20 μg/mL；精密称取灿烂甲酚蓝0.010 0 g，用水定容于100 mL的容量瓶中，备用。

1.2.2 样品处理 将样品洗净，取10 g放入粉碎机中，匀浆。取1.0 g于研钵中，加入2 g无水硫酸镁充分研磨后再与3 g弗罗里硅土研磨均匀。在层析柱底部装1片滤纸，从下至上依次填入无水硫酸镁0.5 g、研磨均匀的混合物、无水硫酸镁0.5 g，每种填料填入后敲实，使填料均匀紧密地分布在柱中，柱上端再加1片滤纸。用10 mL二氯甲烷分2次洗涤研钵和淋洗层析柱，收集洗脱液，40 ℃氮气吹干，加0.1 mL丙酮。

1.2.3 测定方法 在10 mL具塞比色管中依次加入1 mL pH值为10.00的缓冲液、1 mL质量浓度为20 μg/mL的甲基毒死蜱标准品溶液、1 mL质量浓度为1 mg/mL的曲拉通X-100溶液、1 mL质量浓度为100 μg/mL的灿烂甲酚蓝溶液，用水定容至刻度，摇匀、静置5 min，在荧光分光光度计中保持狭缝为5 nm，低压条件下，以 λex=λem同步扫描，得到共振光散射光谱。在最大散射波长544 nm处测得散射强度值为I，不加入农药测得值为I0，则ΔI=I-I0。配制一系列不同质量浓度的甲基毒死蜱标准溶液，利用粒度分析仪测定并记录体系有效粒径值；分别测定其散射强度，并根据ΔI和质量浓度(c)绘制标准曲线，求出回归方程。测定样品处理液和空白对照液在544 nm处的散射强度值，求出ΔI，代入标准曲线回归方程，求出样品处理液中甲基毒死蜱的质量浓度。

2 结果与分析

2.1 共振光散射光谱与吸收光谱

由图1可知，甲基毒死蜱和灿烂甲酚蓝本身的散射强度较弱；而两者在碱性条件下相互作用后，其散射强度显著增大，并在360 nm、544 nm处出现特征散射峰，随着甲基毒死蜱质量浓度的增大体系在最大散射波长处的散射强度值也明显增加，表明能够利用共振光散射法对甲基毒死蜱进行定量检测。由图2可知，随着甲基毒死蜱的加入，体系在550 ～750 nm出现减色效应，在300 ～550 nm出现增色效应，并在550 nm处出现等吸收点。对比图1和图2可以看出，体系的最大散射峰位于其吸收带内，因此能够产生共振增强的散射作用，使散射增强。

1.单独的甲基毒死蜱溶液 (2.0 μg/mL); 2～7.不同质量浓度甲基毒死蜱(0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 μg/mL)与灿烂甲酚蓝、曲拉通X-100作用后的体系图1 甲基毒死蜱-灿烂甲酚蓝体系的共振光散射光谱

1.单独的甲基毒死蜱溶液(2.0 μg/mL); 2～4.不同质量浓度甲基毒死蜱(4.0、2.0、0 μg/mL)与灿烂甲酚蓝、曲拉通X-100作用后的体系图2 甲基毒死蜱-灿烂甲酚蓝体系的的吸收光谱

2.2 动态光散射(DLS)粒度测量

1～3为不同质量浓度甲基毒死蜱(2.0、3.0、4.0 μg/mL)与灿烂甲酚蓝、曲拉通X-100作用后的体系图3 体系DLS粒度测量多分布图

甲基毒死蜱质量浓度/(μg/mL)有效粒径/nm多分散系数2．0226．490．0033．0235．820．0494．0260．310．010

2.3 试验条件的优化

2.3.1 缓冲液酸度的选择 考察不同pH值的B-R缓冲液对体系散射值的影响，结果表明，pH值为10.00时，体系有较大的ΔI(图4)，为最佳pH值。

图4 pH值对体系散射值的影响

2.3.2 灿烂甲酚蓝质量浓度的选择 考察灿烂甲酚蓝质量浓度对体系散射值的影响，结果表明，灿烂甲酚蓝最终质量浓度为10～18 μg/mL时，体系ΔI较大(图5)，试验选择灿烂甲酚蓝的质量浓度为10 μg/mL。

图5 灿烂甲酚蓝质量浓度对体系散射值的影响

2.3.3 反应时间的选择 考察了反应时间对体系散射值的影响，结果表明，体系在5～40 min有较大的ΔI(图6)。本试验选择室温反应5 min。

图6 反应时间对体系散射值的影响

2.3.4 表面活性剂的选择 为改善体系的稳定性，考察了吐温-80、曲拉通X-100、聚乙二醇-6000等表面活性剂对体系的增稳作用，结果表明，曲拉通X-100可在一定程度上增加体系的稳定性和散射值。试验还发现，曲拉通X-100最终质量浓度为80～120 μg/mL时，体系ΔI较大(图7)。本试验选择加入100 μg/mL的曲拉通X-100。

图7 曲拉通X-100质量浓度对体系散射值的影响

2.3.5 样品处理方法的优化 参照文献[19]选择弗罗里硅土作为固相分散剂，分散剂与样品的质量比为3∶1，考察其净化效果，发现当分散剂与样品直接研磨时，由于样品中的水分较多，降低了弗罗里硅土的活性，致使洗脱液中有大量的色素；当样品与无水硫酸镁充分研磨后再与分散剂一起研磨，此时洗脱液较为洁净。

2.3.6 洗脱剂及其用量的选择 考察了乙腈、丙酮、二氯甲烷的洗脱效果，结果表明，乙腈和丙酮作为洗脱剂时洗脱液中有大量的色素，而使用极性较小的二氯甲烷作为洗脱剂时，洗脱液中色素含量较少。同时考察了二氯甲烷用量对农药回收率的影响，当洗脱剂用量为10 mL时，农药的回收率在92.7%～99.4%，增加洗脱剂用量，农药回收率基本不变。因此选择10 mL二氯甲烷作为洗脱剂。

2.4 共存物质的影响

保持10 mL比色管中甲基毒死蜱含量为20 μg，同时加入一定量的共存物质，按照1.2.3方法测定，考察共存物质对体系散射值的影响。当体系测定误差小于±10%时，共存物质的允许量(以质量计)为：淀粉、蔗糖、葡萄糖、Na2S、KBr、NaNO3、Na3PO4、KCl、KAc的允许量均大于2 000 μg，L-丙氨酸、L-蛋氨酸、L-精氨酸、AlCl3为500 μg，L-半胱氨酸为300 μg，BaCl2、ZnSO4、CaCl2、CuSO4为200 μg，FeSO4、FeCl3为80 μg，乙酰甲胺磷、咪唑啉大于600 μg，乙醇、丙酮为600 mg。

2.5 标准曲线及方法灵敏度

配制一系列不同质量浓度的甲基毒死蜱标准溶液，根据测定的ΔI和质量浓度(c)绘制标准曲线，结果如图8所示，其线性回归方程为ΔI=14.881c+1.620 6，相关系数r=0.999 2，线性范围为0.1～5.0 μg/mL，检出限为0.029 μg/mL。

图8 甲基毒死蜱标准曲线

2.6 样品测定结果

取各样品1.0 g，按照方法1.2.2和1.2.3进行处理和测定，结果见表2。4种样品中均未检出甲基毒死蜱残留，平均加标回收率为91.5%～96.8%，与高效液相色谱(HPLC)法[20]对比，结果基本一致。

表2 样品测定及回收试验结果(n=3)

注：ND表示未检出。

3 结论与讨论

本研究建立了一种以共振光散射技术检测样品中甲基毒死蜱残留量的分析方法，甲基毒死蜱质量浓度在0.1～5.0 μg/mL与544 nm处的散射强度有良好的线性关系，检出限为0.029 μg/mL，各样品中甲基毒死蜱的回收率为91.5%～96.8%，能够满足对蔬果中甲基毒死蜱的检测需求。与分光光度法相比，该方法具有更高的灵敏度；与色谱检测技术相比，该方法对设备要求较低，利用普通荧光分光光度计就能完成检测，并且分析快速，可在短时间内完成大批量样品的筛选，同时无须使用大量有机溶剂，节约试验成本。

鉴于蔬果样品的基质较为复杂，基质效应会干扰检测结果，因此本研究对样品前处理过程进行了系列优化。以基质固相分散法作为前处理手段，考察了各填料的研磨顺序对净化效果的影响，同时对比了乙腈、丙酮、二氯甲烷的洗脱效果，并考察了洗脱剂的用量，最终选择样品与无水硫酸镁充分研磨后再与分散剂研磨，并以10 mL二氯甲烷作为洗脱剂来提取、净化蔬果样品中的甲基毒死蜱，可以降低样品基质对试验测定的干扰，确保试验结果的可靠性。

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Determination of Chlorpyrifos-methyl in Vegetables and Fruit by Matrix Solid-Phase Dispersion Extraction and Resonance Light Scattering Method

ZHANG Chuanlin,HU Qinghong*
(School of Pharmacy,Zunyi Medical College,Zunyi 563003,China)

This study aimed to establish a new resonance light scattering(RLS) method for determination of chlorpyrifos-methyl in vegetables and fruit,providing technical support for rapid detection of chlorpyrifos-methyl in vegetables and fruit.In Britton-Robinson buffer (pH=10.00),with Triton X-100 as a stabilizer,the RLS intensity of chlorpyrifos-methyl greatly enhanced when brilliant cresyl blue was added.The scattering peaks were located at 360 nm and 544 nm.The RLS intensity was linear to the concentration of chlorpyrifors-methyl in the range of 0.1—5.0 μg/mL at 544 nm with a detection limit of 0.029 μg/mL.Several samples were purified by matrix solid-phase dispersion(MSPD) and then determined.The average recoveries of chlorpyrifos-methyl in these samples ranged from 91.5% to 96.8%.This method was quick and sensitive for determination of chlorpyrifos-methyl residues in vegetables and fruit.

resonance light scattering; chlorpyrifos-methyl; brilliant cresyl blue; matrix solid-phase dispersion

2015-12-30

贵州省科学技术基金项目[黔科合J字LKZ(2011)44]

张传林(1990-)，男，江苏盐城人，在读硕士研究生，研究方向：分子光谱的分析应用。 E-mail：zhangcl1215@163.com

*通讯作者：胡庆红(1963-)，男，贵州遵义人，教授，主要从事分子光谱的分析应用研究。 E-mail:huqinghong1963@126.com

S481+.8

A

1004-3268(2016)08-0081-05