壳寡糖抑菌及抗氧化性的研究

臧 珉 ，陈 斌

(1.南京锐博科技股份有限公司，江苏 南京 210006；2.菲尼克斯生物化学(苏州)有限公司，江苏 苏州 215200 )



壳寡糖抑菌及抗氧化性的研究

臧 珉1，陈 斌2

(1.南京锐博科技股份有限公司，江苏 南京 210006；2.菲尼克斯生物化学(苏州)有限公司，江苏 苏州 215200 )

本文通过经典的Fenton反应方法建立体系研究壳寡糖清除羟基自由基能力，邻苯三酚在碱性条件下发生自氧化反应体系研究壳寡糖清除超氧阴离子的能力，以及总抗氧化能力测定。同时以棉花枯萎病菌及烟草赤星病菌为受试菌种, 采用生长速率法研究壳寡糖对植物病原真菌的抑制作用。壳寡糖对羟基自由基清除率IC503.78 mg/mL，超氧阴离子清除率IC503.3 mg/mL，5g/L壳寡糖对棉花枯萎菌、烟草赤星菌菌丝生长的抑制率达20%和14%。研究结果表明壳寡糖具有较强抗氧化能力，并且有一定抑菌作用的生物活性寡糖，有很广阔的应用前景。

壳寡糖；羟自由基清除率；超氧阴离子清除率；总抗氧化能力；抑菌

壳寡糖对清除超氧阴子有一定效果，超氧自由基(即超氧阴离子自由基, O2-·) 是一种外层轨道含有未配对电子的特殊状态分子的活性氧。它与人体的健康有密切的关系， O2-·的异常产生则会直接或间接的损害细胞, 它们攻击生物大分子( 如： 脂质、蛋白质、核酸等) 引起超氧化反应, 使其交联或断裂, 引起细胞结构和功能的破坏, 导致机体衰老、炎症、癌症、高脂血症、肝细胞的损伤等。

羟自由基是体内最活泼的活性氧，是一种氧化能力很强的自由基，可导致许多病理变化，在生物体内，羟自由基可以引发不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，并损伤膜结构及功能，使糖类、氨基酸、蛋白质、核酸和脂类等都发生氧化，使物质的氧化性遭受损伤和破坏，造成细胞坏死或突变[5]。羟自由基的检测对于自由基的生物作用研究有重要意义，羟自由基清除率是反映药物抗氧化作用的重要指标。

总抗氧化能力(Total Antioxidant Capacity，T-AOC)对于衡量一种物质的抗氧化能力是一个指标，在机体防御体系的抗氧化能力的强弱与健康程度存在着密切联系,该防御体系有酶促与非酶促两个体系,许多酶是以微量元素为活性中心，非酶促反应体系中主要为维生素、氨基酸和金属蛋白质。例如:VE、胡萝卜素、VC、半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸、组氨酸、葡萄糖、铜兰蛋白、转铁蛋白、乳铁蛋白等。这个体系的防护氧化作用主要通过三条途径:(1)消除自由基和活性氧以免引发脂质过氧化；(2)分解过氧化物，阻断过氧化链；(3)除去起催化作用的金属离子。防御体系各成份之间相互起到了协同作用，以及代偿作用与依赖作用，测定壳寡糖的总抗氧化能力对评价其抗氧化性有一定意义。

1 材料和方法

1.1 材料

原料与试剂：壳寡糖(扬州日兴生物科技有限公司)；棉花枯萎菌(南京野生植物综合利用研究院)；烟草赤心病菌(南京野生植物综合利用研究院 )；总抗氧化能力(T-AOC)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠 、硫酸亚铁 、30%过氧化氢、水杨酸钠 、抗坏血酸(Vc)、 三羟甲基氨基甲烷、邻苯三酚 、盐酸等均为分析纯。

实验仪器： 手提式不锈钢高压蒸汽消毒器，上海三申医疗器械有限公司；EL204电子天平， 梅特勒-托利多仪器有限公司；HH-2数显电子恒温水浴锅，金坛市江南仪器厂；721分光光度计，上海第三分析仪器厂；超净工作台；DL-102A型电热鼓风干燥箱，江苏省东台县电器厂。

1.2 方法

1.2.1 清除羟自由基的能力

根据经典Fenton反应的方法建立反应体系，利用H2O2与Fe2+混合产生·OH，但由于·OH具有很高的反应活性，存活时间短，在反应体系中加入水杨酸，能有效地捕捉·OH，并产生有色产物[7-8]。反应式如下：H2O2+ Fe2+→Fe3++·OH+OH-，该产物在510 nm处有强吸收，若在此反应体系中加入具有清除·OH功能的被测物，便会与水杨酸竞争·OH，从而使有色产物生成量减少。

采用固定反应时间法，在体系中加入0.2 mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液PBS，5.5 mmol/L FeSO4溶液(棕色瓶避光保存)，6.4 mmol/L EDTA-2Na，0.2% H2O2，10 mmol/L 水杨酸钠和一定体积的样品溶液，蒸馏水定容至8.0 mL，摇匀。37 ℃恒温水浴1 h，于510 nm测定不加样管的吸光度A标和加样管的吸光度A样。加样管的吸光度用试样空白校正，试管空白管中含有3.0 mL 100 mmol/L磷酸盐缓冲溶液，1.0 mL 5.5 mmol/L FeSO4，1.0 mL 6.5 mmol/L EDTA-2Na，1.0 mL 10 mmol/L水杨酸和一定体积的样品溶液,加水至8.0 mL，吸光度为A样空白。按下式计算·OH清除率：

配置不同浓度(0,3,4,5,6 mg/mL)的壳寡糖溶液，每个浓度重复测定3次，吸光度取平均值，测量不同浓度样品对其羟自由基的清除率，并以相同浓度Vc为参照，通过清除率比较两者对羟自由基的清除能力。

1.2.2 清除超氧阴离子的能力

邻苯三酚在碱性条件下发生自氧化反应, 产生稳定浓度的超氧阴离子自由基(O2-· )与中间物, 中间物又与超氧阴离子自由基(O2-·)反应, 得到一种带有颜色的中间产物,此物在紫外有吸收, 引起某一波长处吸光值的线性积累, 来反应抗氧化剂的清除能力的大小[9-10]。

在体系中先加入pH8.2 Tris-HCl缓冲液4.5 mL，样品0.1 mL，空白管加蒸馏水，25 ℃恒温水浴锅预热20 min，加入0.4 mL邻苯三酚，再次25 ℃水浴5 min，最后加入2滴 8 mol/L HCl终止反应，于325 nm处测定加样与空白管的吸光度，用蒸馏水调零。

配置不同浓度(0,1.5,3,6 mg/mL)的壳寡糖溶液，每个浓度重复测定3次，吸光度取平均值，测量不同浓度样品对其羟自由基的清除率，并以相同浓度Vc为参照，从过清除率比较两者对羟自由基的清除能力[11]。

1.2.3 总抗氧化能力

通过总抗氧化能力(T-AOC)试剂盒测定，测定原理为机体中有许多的抗氧化物质，能使Fe3+还原成Fe2+，后者可与菲啉类物质形成稳固的复合物，通过比色可测出其抗氧化能力的高低。

在这部分实验中，取壳寡糖的浓度为10 mg/mL，Vc的浓度为10 mg/mL，分别做3个平行。

T-AOC单位定义为，在37℃时，每分钟每毫升样品是反应体系的吸光度(OD)每增加0.01时，为一个总抗氧化能力单位。

1.2.4 抑菌实验

菌种的活化：将棉花枯萎病菌和烟草赤心病菌两种植物病原真菌，在超净台下用小刀切取连带培养基生长处于对数期长势较好的菌丝体，菌丝体一面贴于已灭菌的PDA培养基，置于恒温培养箱中进行培养3～6 d。

拉胶寡糖主要是由D-半乳糖及其衍生物以α-1，3和β-1，4键交替连接而成的酸性硫酸寡糖, 由海洋中的红藻多糖降解得到。卡拉胶及其寡糖具有显著的抗病毒、辐射防护及免疫方面的生理活性。采用卡拉胶寡糖为对照，比较壳寡糖的抗植物病原真菌的特性。

壳寡糖和卡拉胶寡糖对菌丝生长的影响采用生长速率法测定。用无菌水将壳寡糖Ⅰ和卡拉胶寡糖分别配成溶液进行过滤除菌。取15 mL不同浓度的寡糖溶液加入溶化后冷却至50 ℃左右的150 mL PDA中(对照组加入15 mL无菌水)，摇匀后倒至平板，制成含0、0.5、1、2、5 g/L 寡糖的培养基。将各供试菌接种于PDA平板，25℃下培养4 ～6 d, 用打孔器从各供试菌的菌落边缘打取直径为6 mm的菌饼，菌丝面向下，接入配好的含寡糖的培养基中，置于恒温箱( 25 ℃) 中培养。接种3d或6d后，测定各处理菌落的直径大小，并与对照组进行比较，计算其相对抑制百分率。

2 结果与讨论

2.1 壳寡糖清除羟自由基的能力

维生素C具有较强的清除羟自由基活性,由图1可知,同浓度的壳寡糖对羟自由基表现出与维生素C相近的清除效果，并且随着浓度的增大，清除率也随之增加，量效显著。同时，经过分析，壳寡糖IC50为3.78 mg/mL，维生素C IC50为3.83 mg/mL，也说明壳寡糖的清除羟自由基的能力与维生素C具有一定的可比性。通过图1也可发现，维生素C在浓度增加到5 mg/mL时已达到一定峰值，浓度继续升高则清除率有减小的趋势，而壳寡糖在6 mg/mL时却仍然有清除羟自由基清除率增加的趋势。说明壳寡糖对于清除羟自由基有一定的潜力，有广阔的研究前景。

图1 羟自由基的清除率

2.2 壳寡糖清除超氧阴离子的能力

在碱性条件下，邻苯三酚发生自氧化反应，生成超氧自由基和有色中间产物，该有色产物有特征吸收峰。当加入自由基清除剂时，超氧自由基的生成受到抑制，邻苯三酚自氧化过程受阻，特征吸收峰减弱，具体由清除率表示清除作用的相对大小。

壳寡糖对超氧阴离子的清除能力作用见图2。由图2可知，壳寡糖对超氧阴离子自由基表现出一定的清除效果，并且随着加入量浓度的增大，清除率也随之增加，通过数据分析，维生素C的IC50为2.57 mg/mL，而壳寡糖的IC50为3.3 mg/mL，与维生素C相比清除超氧阴离子的能力略低，维生素C在人体内，是高效抗氧化剂，实验数据表明壳寡糖清除超氧阴离子能力接近维生素C。

图2 超氧阴离子的清除率

2.3 壳寡糖总抗氧化的能力

通过总抗氧化能力(T-AOC)测定试剂盒得到数据，壳寡糖的总抗氧化能力为192.3单位/毫升样品，而维生素C为214.7单位/毫升样品，壳寡糖的总抗氧化能力较强，进一步表明壳寡糖具有较好的抗氧化性。

2.4 壳寡糖的抗植物病原真菌的能力

表1 壳寡糖对两种病原真菌生长抑制率

表2 卡拉胶寡糖对两种病原真菌生长抑制率

3 小 结

羟自由基清除率壳寡糖的IC50为3.78 mg/mL，维生素C的IC50为3.83 mg/mL，表明壳寡糖的清除羟自由基的能力与维生素C具有一定的可比性。维生素C在浓度增加到5 mg/mL时已达到一定峰值，浓度继续升高则清除率有减小的趋势，而壳寡糖在6 mg/mL时却仍然有清除羟自由基清除率增加的趋势。壳寡糖作为一种自由基清除剂能够抗衰老, 体内组织中的自由基清除剂浓度越高, 防御自由基损伤的能力也越强, 寿命也就越长。

壳寡糖对超氧阴离子自由基表现出一定的清除效果，并且随着加入量浓度的增大，清除率也随之增加，维生素C的IC50为2.57 mg/mL，而壳寡糖的IC50为3.3 mg/mL，维生素C在人体内，是高效抗氧化剂，研究结果表明壳寡糖有接近维生素C的超氧阴离子自由基清除能力。

壳寡糖的总抗氧化能力为192.3单位/毫升样品，而抗坏血酸为214.7单位/毫升样品，进一步证明壳寡糖具有较强的抗氧化性。

壳寡糖对棉花枯萎病菌及烟草赤星病菌菌丝生长均有一定程度的抑制作用，5 g/L壳寡糖对棉花枯萎菌、烟草赤星菌菌丝生长的抑制率达20%和14%。壳寡糖在日化、食品中的抑菌实验将进一步开展研究。

壳寡糖具有较强抗氧化能力，并且有一定抑菌作用的生物活性寡糖，在食品医药、天然日化、农业等领域具有很广阔的应用前景。

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Study on the Antibacterial Activity and Antioxidant Activity of Chitosan Oligosaccharide

Zang Ming1，Chen Bin2

(1.Nanjing Reboo Science and Technology Co., Ltd., Nanjing 210006，China; 2. Phoenix Biochemical (Suzhou) Co., Ltd., Suzhou 215200，China)

This paper studied the hydroxyl radicals scavenging ability and superoxide anion scavenging ability of chitosan oligosaccharide by establishing the classical Fenton reaction system and autoxidation reaction system of pyrogallic acid under alkaline conditions respectively. The total antioxidant capacity of chitosan oligosaccharide was also determinated. Meanwhile, through the growth rate method, inhibiting effect of chitosan oligosaccharide to plant pathogenic fungi were studied by usingFusariumoxysporumandAlternariaalternata. The results showed that IC50of chitosan oligosaccharide to hydroxyl radical and superoxide anion was 3.78 mg/mL and 3.3 mg/mL respectively. Inhibition rate of 5 g/L chitosan oligosaccharide to mycelial growth ofF.oxysporumandA.alternatawas 20% and 14% respectively. This indicated that chitosan oligosaccharide has a strong antioxidant capacity, and there is a certain antimicrobial biological activity. Chitosan oligosaccharide has a broad application prospect.

Chitosan oligosaccharide; hydroxyl radical scavenging rate; superoxide anion scavenging rate; total antioxidant capacity; antibacterial activity

10.3969/j.issn.1006-9690.2016.06.007

2016-05-22

江苏省产学研联合创新资金(BY2014019)。

臧珉，男，工程师，从事天然日化产品的研究与开发工作。

Q946

A

1006-9690(2016)06-0027-04