抗雏番鸭细小病毒鸡源卵黄抗体的制备及保护效果研究

张元元 ， 刘 璐 ， 刘倩宏 ， 苏友鹏

(吉林农业科技学院动物科技学院 ， 吉林吉林132101)



抗雏番鸭细小病毒鸡源卵黄抗体的制备及保护效果研究

张元元 ， 刘 璐 ， 刘倩宏 ， 苏友鹏

(吉林农业科技学院动物科技学院 ， 吉林吉林132101)

雏番鸭细小病毒病(MDPVD)，俗称“三周病”，该病是由番鸭细小病毒引起的3周龄内的雏番鸭发病。病番鸭表现为脚软、呼吸困难及腹泻为主要症状，该病的死亡率可达40%～50%以上,给养鸭业造成巨大危害。目前控制本病的方法主要为疫苗免疫接种及一些综合防制措施，对发病动物采用番鸭超免卵黄抗体或超免血清作被动免疫，进行紧急治疗。但由于鸭源抗体成本较高、来源有限，本研究采用雏番鸭细小病毒灭活苗、弱毒苗联合免疫成年产蛋母鸡，制备鸡源MDPV卵黄抗体，并对制备的卵黄抗体进行评价，为临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物 试验动物为成年来杭蛋鸡(本校鸡场)，体重为2kg/只。

1.2 主要试剂 MDPV灭活苗、弱毒苗，均购自科特威生物科技公司；弗氏完全佐剂和不完全佐剂，购自Sigma公司；辣根过氧化物酶HRP标记的羊抗鸡抗体及DAB显色试剂盒，购自上海生工生物工程技术服务有限公司；其他试剂均为国产分析纯级试剂。

1.3 动物免疫及抗体效价检测 于免疫前3d收集鸡蛋作为对照。以MDPV灭活苗(1mL)混合弱毒苗(1头份/只)首免成年蛋鸡，采取胸部肌肉多点注射。一免、二免间隔1周，以后每次免疫间隔10d。二免、三免接种剂量分别为2mL(灭活苗)+10头份/只(弱毒苗)，3mL(灭活苗)+100头份/只(弱毒苗)，接种途径与首免相同。

于三免后开始用中和试验检测高免蛋中的抗体效价，待抗体水平上升到一个较高水平时，开始收集高免蛋。

1.4 卵黄抗体制备及纯化 将收集的鸡蛋用水冲洗干净后，依次使用碘酒和75%酒精擦拭消毒后，超净工作台中无菌分离卵黄，与等体积灭菌磷酸盐缓冲液(PBS)捣碎匀浆后，参照胡庆松等[1]的硫酸铵盐析法纯化卵黄抗体，无菌操作。

1.5 测定卵黄抗体的中和效价和纯度 采用鸡胚中和试验法测定卵黄抗体MDPV的中和效价，同时设立对照组，观察鸡胚病变及死亡情况，并用统计学方法计算卵黄抗体中和效价。卵黄抗体中残留的硫酸铵用透析法除去，卵黄抗体纯度(纯化前、后)检测采用SDS-PAGE法分析，具体操作参见文献[1]。

1.6 制备卵黄抗体微生物学及安全性检测 将卵黄抗体接种于普通营养琼脂培养基，37 ℃温箱内培养48 h，观察有无细菌生长。抓取雏鸭8只，注射卵黄抗体，每只2 mL。观察雏鸭食欲、精神状态、有无腹泻等异常反应，观察至72 h后，剖检雏鸭，观察实质脏器及免疫器官有无病理变化。

1.7 卵黄抗体治疗效果观察 将 20 只3周龄健康雏鸭随机分成 4 组，I组、II 组、III 组为试验组，IV 组为对照组，攻毒后隔离饲养。各组肌肉注射病毒液(临床分离，本室保存)1.0 mL，48 h 后 I、II、III 组每日分别肌肉注射卵黄抗体 0.3、0.5、1.0 mL，连续注射 3 d，观察至 14 d分析卵黄抗体不同使用剂量对患鸭的治疗效果。

2 结果

2.1 卵黄抗体效价测定及纯度检测 采用中和试验测定卵黄抗体中和效价为1∶120，对照组效价为 1∶2。抗体纯度检测，经硫酸铵梯度沉淀后卵黄抗体得到了较好纯化。

2.2 卵黄抗体微生物学检测及安全性检测 经微生物学检测，平板上无任何菌落生长(图略)。接种卵黄抗体的雏鸭经观察，无任何异常表现。

2.3 卵黄抗体治疗效果检测 对照组(IV组)的死亡率高达80%，而试验组的保护率可分别达到40%、80%及100%，当卵黄抗体肌肉注射0.5mL时即可对雏鸭产生较好的治疗效果。

3 讨论

随着番鸭在我国流动性的增加，目前该病在很多省份都有流行，是危害番鸭养殖的重要传染病之一。由于该病由MDPV引起，缺乏有效的治疗药物，主要依靠疫苗紧急免疫接种、高免血清等进行治疗。疫苗不能在短时间产生免疫保护，高免血清价格贵，来源不易得，卵黄抗体成为了治疗该病的必然选择。

本研究利用成年产蛋鸡作为卵黄抗体的来源，进一步降低了卵黄抗体的价格；产蛋母鸡经特异性抗原免疫后，可以产生持久性应答反应，抗体效价可维持数月之久；卵黄抗体耐酸、耐碱、耐热，理化性质非常稳定，保存方便。

研究采用灭活苗和弱毒疫苗联合免疫的方法，结果表明，此种免疫方法能够强烈地激发机体的免疫水平，不仅制备的卵黄抗体效价可以达到较高的水平,而且临床试验也取得了较好的治疗效果，表明以鸡制备MDPV超免卵黄抗体是可行的。

[1] 胡青松，李吕木，张小飞,等.猪流行性腹泻病毒3种抗原卵黄抗体的制备，西北农林科技大学学报(自然科学版)[J].2015,11(43),35-40.

[2] 刘倩宏,吴清民,刘红卿,等.布鲁氏菌外膜蛋白OMP25的原核表达与鉴定，中国兽医杂志[J].2008，44(8):18-19.

2016-01-08

吉林农业科技学院重点学科培育项目(X068号)资助

张元元(1995-)，女，本科生，就读于动物科学专业，E-mail:930076996@qq.com

刘倩宏，E-mail:qianhongliu@126.com

S852.65+9.2

B

0529-6005(2016)10-0044-01