狂犬病病毒糖蛋白生物学功能研究进展

汪孟航，朱洪伟，何民辉，温永俊，程世鹏

（中国农业科学院特产研究所，特种经济动物分子生物学重点实验室，长春130112）

狂犬病病毒糖蛋白生物学功能研究进展

汪孟航，朱洪伟，何民辉，温永俊＊，程世鹏

（中国农业科学院特产研究所，特种经济动物分子生物学重点实验室，长春130112）

摘 要：狂犬病是由狂犬病病毒（rabies virus，RABV）感染中枢神经系统引起的致死性人畜共患传染病。RABV糖蛋白存在于病毒表面，它既是病毒的主要保护性抗原，诱导体液免疫产生中和抗体和刺激T细胞产生细胞免疫，又是病毒与细胞受体结合的结构，在病毒致病性和嗜神经性中发挥重要作用，与病毒毒力直接相关。作者归纳总结国内外RABV糖蛋白结构与功能研究进展，并对糖蛋白中和抗体的检测与评价进行阐述。将为进一步揭示RABV糖蛋白生物学功能奠定基础，为糖蛋白中和抗体的诊断提供理论参考，为控制和消灭狂犬病做出相应贡献。

关键词：狂犬病；糖蛋白；中和抗体

狂犬病（rabies）是一种可感染人与所有温血动物的烈性人畜共患传染病，是迄今为止病死率最高的急性传染病，感染者一旦发病，死亡率几乎为100%。狂犬病的感染途径主要是病兽或带毒兽咬伤，主要的带毒动物有犬、浣熊、臭鼬、蝙蝠和狐狸［1］。狂犬病病毒（rabies virus，RABV）是引发狂犬病的病原体，属于弹状病毒科（Rhabdoviridae）、狂犬病毒属（Lyssavirus）、血清Ⅰ型病毒，1885年由Loues Pasteur首次分离。狂犬病病毒属可以分为7种不同基因类型，分别是经典狂犬病病毒（RABV）、DUVENHAGE病毒（DUVV）、拉各斯蝙蝠狂犬病病毒（LBV）、mokola病毒（MOKL）、欧洲蝙蝠病毒属（EBLV，分为两种：基因5型和基因6型，及澳大利亚蝙蝠病毒属（ABLV）。RABV颗粒在电子显微镜下呈现子弹状，直径约为75nm，长度为100～300nm。RABV基因组为单股负链不分节段RNA，基因组大小为11 928或11 932bp，含有5种结构基因，从3′端到5′端依次排列为N、P、M、G和L基因。基因组在聚合酶的作用下将5种结构基因转录为初级mRNA，经历加帽、甲基化和多聚腺苷酸化后转变为成熟mRNA，分别编码核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、糖蛋白（G）和大蛋白（L）。M蛋白形成病毒主要骨架结构，维持病毒正常形态，还可以刺激增强病毒复制，且具有抑制病毒转录的作用。N蛋白紧密包裹着病毒RNA，构成螺旋状核衣壳结构，避免基因组RNA遭到细胞核酸酶的破坏，且有研究证实病毒基因组RNA的转录与复制受控于N基因的表达。P蛋白与L蛋白不仅参与组成核衣壳，更在病毒的复制与转录中发挥着重要作用，研究证实N蛋白未与P蛋白、L蛋白相互作用时，病毒的复制与转录就会出现减少现象［1］。G蛋白是唯一存在于RABV表面的蛋白，它既是RABV的主要保护性抗原，能诱导机体体液免疫产生中和抗体和刺激T细胞作用产生细胞免疫，又是RABV与细胞受体结合的结构，在病毒致病性和嗜神经性中发挥重要作用，与病毒毒力直接相关。鉴于G蛋白在病毒结构蛋白中的重要地位，作者将归纳总结国内外RABV糖蛋白结构与功能的相关研究，并对糖蛋白中和抗体的检测与评价进行阐述，为进一步揭示RABV糖蛋白的生物学功能奠定基础。

1 RABV糖蛋白

G蛋白存在于病毒颗粒表面，其抗原位点可识别宿主细胞的受体并与之结合，在病毒致病性和嗜神经性中发挥重要作用。G蛋白基因只含有一个ORF，共含有1 675、2 059或2 069个核苷酸，编码序列长1 575bp。在RABV 5种结构基因中G蛋白基因的变异率最大，同一基因型不同地区的同源性为80%～100%，不同基因型间的同源性只有50%～75%［2］。G蛋白由524个氨基酸组成，前19个氨基酸构成疏水性信号肽，成熟过程中信号肽被切除，最终含有505个氨基酸，相对分子质量为56ku，等电点为6.7。

成熟G蛋白从结构上分为3个部分：膜外区，即1－439位氨基酸，该区携带有RABV主要抗原决定位点，具有强大的免疫原性和抗原性，在受体识别和膜融合过程中发挥着重要作用；跨膜区，即440－461位氨基酸，该区参与G蛋白在病毒脂质双分子层膜上的固定；膜内区，即462－505位氨基酸，该区位于病毒包膜内，并与基质蛋白与核蛋白相互作用有关。G蛋白功能区单一氨基酸的保守与稳定有利于蛋白完整功能的体现，如成熟G蛋白第36位苏氨酸被脯氨酸替代后，RABV中和抗体无法中和该突变毒株；第39位丝氨酸被苏氨酸替代后，G蛋白的空间构象发生改变；第461位半胱氨酸残基的棕榈酸化，可将G蛋白在脂质双分子层膜上固定，稳定G蛋白空间构象并保持其完整功能［3］。另外还发现了一种存在于病毒细胞培养液中的可溶性G蛋白（Gs），在抗原性上Gs与G蛋白相差不大，但Gs无法正常结合于病毒颗粒包膜，该病毒颗粒也无法具备正常的感染能力，甚至激发动物机体产生的中和抗体都出现减少现象，只有G蛋白的1／15左右，这些改变是由于在结构上Gs的C末端跨膜区缺失58个氨基酸残基［4］。

G蛋白是RABV结构蛋白中唯一能刺激机体产生中和抗体的蛋白抗原，其蛋白抗原性主要依赖于空间构象表位，主要的抗原位点有GⅠ区、GⅡ区和GⅢ区。GⅠ区既包含空间构象抗原表位，又包含线性抗原表位，该抗原位点相对独立，位于226－231位氨基酸区段。GⅡ区抗原保守性较高，具有典型的不连续性空间构象抗原表位，两个主要抗原表位区34－42（GⅡb）和198－200（GⅡa）通过二硫键相互连接，构成G蛋白空间构象。GⅢ区是G蛋白中最主要的抗原位点，包含一段连续的空间构象表位，位于330－338位氨基酸区段。具有空间构象的GⅡ和GⅢ区不仅是RABV特异性中和抗体的主要结合位点，而且在蛋白折叠与运输中具有重要作用。目前，G蛋白上还发现了其他的线性中和抗原位点GⅤ区，该位点免疫原性较弱，位于261－264位氨基酸区段，该区在不同RABV毒株中高度保守。除了线性位点以外，G蛋白还存在有依赖于单一氨基酸的抗原位点，如位于251位氨基酸的GⅣ区；位于264位氨基酸的GⅥ区，GⅥ区存在于GⅤ区内部［5］。

G蛋白是病毒基因组结构蛋白中唯一的糖基化蛋白，蛋白中糖基化位点和数目随不同毒株而改变。一般情况下，具有N－X－T蛋白结构的糖基化效率普遍高于N－X－S蛋白结构，苏氨酸位点的糖基化效率可比丝氨酸位点高出2～3倍。在成熟G蛋白中发现了3个主要的糖基化位点：第37位氨基酸糖基化位点，该位点糖基化作用较弱，多数存在于RABV基因Ⅰ型当中。第158或247位氨基酸糖基化位点，该位点分布较集中，但并不普遍存在，同样多数存在于基因Ⅰ型病毒当中。第319位氨基酸糖基化位点，该位点是RABV最主要的糖基化位点，存在于目前所有已知的RABV中，试验证明利用基因工程手段敲除该位点，病毒G蛋白的免疫原性出现减弱现象，并且推测该位点可能与G蛋白的正确折叠和运输密切相关［2］。糖基化结构的存在对RABV G蛋白发挥其完整的生物学功能和病毒识别具有至关重要的作用。

2 糖蛋白的生物学功能

2.1糖蛋白与宿主免疫的关系

RABV G蛋白是病毒基因组结构蛋白中的主要保护性抗原，具有B细胞、T细胞识别位点，能够诱导宿主细胞发生细胞免疫和体液免疫应答，刺激宿主分泌中和性抗体。G蛋白上的B细胞表位识别位点主要位于GⅡ区和GⅢ区，刺激机体产生具有保护作用的IgG免疫球蛋白。假如利用基因工程手段敲除小鼠的B细胞基因，抑制抗病毒中和性抗体的产生，那么疫苗就不能保护宿主抵抗RABV的攻击。将RABV G蛋白基因克隆入其他病毒载体构建的狂犬病毒工程疫苗，可成功刺激机体产生中和抗体，抵抗病毒攻击。在细胞免疫应答方面，G蛋白上的T细胞抗原表位既包含有空间构象型，也包含有线性型，能够有效的刺激T淋巴细胞诱导免疫应答。激发的CD8＋T细胞能够直接对靶细胞进行杀伤，杀死发生病变的神经细胞，进而清除中枢神经系统中狂犬病毒颗粒，最终引起免疫性病理现象的发生［6］。但是，CD8＋T细胞介导的免疫应答在抗病毒中并不起主要作用，并且其杀伤性具有潜在的危险性，所以应尽量诱导宿主机体产生B细胞免疫反应和CD4＋T细胞免疫反应。Sato等［7］通过比较基因缺失病毒与完整病毒基因的表达水平来验证G蛋白的作用，该项研究分析了3种不同重组病毒的转基因表达水平与病毒转录，证实G基因缺失后病毒转录表达水平升高，但是缺失病毒出现免疫原性下降现象，且G蛋白具有细胞毒性作用。Hu等［8］利用G蛋白基因嵌入痘病毒载体制备重组病毒，证实可诱导免疫动物的体液免疫产生中和抗体和刺激T细胞作用产生细胞免疫。Huang等［9］利用5型副流感病毒作为载体，表达狂犬病毒的G蛋白，作为狂犬病预防和治疗的手段，结果发现该重组病毒可使小鼠免受病毒感染至少6d，有潜力作为一种新型预防狂犬病的方法。类似的疫苗技术已经在美国及欧洲广泛使用，有效控制了该地区野生动物狂犬病的流行。

成熟G蛋白分子上约有3个糖基化位点，糖蛋白的糖基化程度与病毒免疫原性息息相关，且G蛋白分子上的某个氨基酸位点的糖基化可能会增强该蛋白分子的另一端位点糖基化的发生。试验证实Asn（247）位点糖基化可以增强Asn（319）位点糖基化的发生，促使机体产生更强的免疫识别。若降低G蛋白的糖基化程度，则诱导产生的中和抗体含量将大大减少［10］，其原因可能是G蛋白被糖基化修饰后，使得抗原表位更加突出于表面，增强其免疫原性。

2.2糖蛋白与宿主细胞受体的关系

RABV侵染宿主细胞的过程中，需要与宿主细胞表面受体结合并识别，其中病毒表面囊膜G蛋白具有介导该结合过程的最主要作用。烟碱乙酰受体（NachR）是众多RABV细胞受体中第一个被发现的，主要存在于肌肉细胞的突触后膜，有研究显示，动物机体肌细胞中的烟碱乙酰受体含量越高，该动物对RABV就越易感，两者呈正相关。RABV G蛋白具有的四肽空间结构Asn194Ser195Arg196Gly197中，Arg196残基上的氨基和Asn194残基的羧基组成的空间构象与NachR空间构象有较高相似度，进一步表明G蛋白具有结合烟碱型受体的结构。利用蛋白质序列同源性分析，以及活性结合NachR试验，发现RABV G蛋白和蛇毒箭毒样神经毒素蛋白具有同源性，其中G蛋白的第184－214位氨基酸与蛇毒神经毒素蛋白的环形结构同源性最高，进一步的试验表面金环蛇神经毒素单克隆抗体可对狂犬病毒与NachR的结合产生抑制作用［11］。然而研究人员发现，RABV仍然可以感染缺乏NachR的细胞系，进一步利用蛇毒处理降低细胞感染比例也没有达到预想效果，这表明除了烟碱乙酰受体还涉及到其他受体分子。

神经细胞黏附分子（NCAM）是RABV的新一类细胞受体，该受体的发现是通过不同细胞株相互比较发现的。利用特异性抗体或者硫酸素占据细胞表面上的神经细胞黏附分子结合部位阻断NCAM，将降低细胞感染狂犬病病毒比例。相反，通过转染NCAM提高细胞表达量，该细胞的病毒易感性也随之增大。进一步研究表明，感染前将病毒分子与NCAM预处理，该病毒失去再感染BSR细胞的能力。动物试验结果一致，同剂量病毒分别感染野生鼠与缺少NCAM小鼠，缺乏鼠的死亡时间明显延长［11－12］。RABV表面G蛋白具有吸附NCAM作用，占据NCAM位点后病毒增殖能力将受到影响。

此外，还有一些种类的狂犬病毒受体被不断发现。神经营养因子受体（p75NTR）被证实为RABV 1型与6型病毒受体，通过转染p75NTR进入RABV耐受BSR细胞株，该细胞株重新转变为RABV易感细胞［13］。神经营养因子受体与病毒G蛋白结合参与病毒的内吞与运输。也有报道RABV吸附细胞膜表面的神经节苷脂及磷脂，可感染非神经组织细胞并繁殖［11］。

2.3糖蛋白与病毒致病性的关系

狂犬病的致病性与病毒对神经的侵染能力有关，具有严格的神经嗜性，能引起所有温血动物中枢神经系统致死性感染。主要危害感染机体的神经系统，病毒在神经元细胞浆内聚集、增殖形成包涵体，RABV能引起神经递质分泌异常和离子通道功能异常。

RABV强毒株与驯化后的弱化毒株在神经亲嗜性程度上明显不同，从外周感染部位侵犯中枢神经系统（central nervous system，CNS）的能力不同。原因主要是病毒基因结构中的糖蛋白（G蛋白）的不同，组织弱化毒株从外周侵犯CNS的能力丧失或有限，而强毒株具有高神经亲嗜性［14］。研究人员比较了RABV强毒株（SHBRV）与实验室弱化毒株（CVS－B2C）的临床表现、致病性及病理变化。结果发现，SHBRV的毒力比CVS－B2C强100～1 000倍，CVS－B2C可在中枢神经系统引起广泛的炎症，包括神经细胞退行性病变、坏死和凋亡，淋巴细胞和单核细胞浸润，胶质细胞增殖等。相反，SHBRV感染小鼠大脑的病理变化非常轻微，凋亡细胞及CD3＋炎症细胞数量显著低于CVS－B2C感染小鼠［15］。狂犬病的致病性与病毒对神经的侵染能力有关，不同病毒株从外周部位进入神经系统的能力有明显差异，这主要跟RABV G蛋白有关。Ghanem等［16］利用G蛋白与神经细胞侵染能力的关系，将G基因缺失构建重组病毒，使用现代光学追踪法研究RABV在神经元回路中的感染途径。还有研究表明，RABV固定株（ERA、HEP、CVS）的致病性与位于G蛋白的Ⅲ位点抗原决定簇存在有关；在成年鼠内不管接种剂量和接种途径，由于G蛋白氨基酸的333位点的突变，使得Arg变成为Gln、Glu、Gly，RABV的致病力大大的降低［17］。Etessami等［18］研究表明，缺失G基因的重组RABV可以感染神经元，但不能传播到下一级神经元；说明G蛋白在RABV狂犬病病毒从突触前穿行到突触后这一过程中扮演了一个很重要的角色。

狂犬病强毒株在神经细胞内复制，通过低表达G基因和阻碍促凋亡因子的产生；通过FasL及B7－H1途径导致游走性T细胞死亡，同时还能保护神经元的轴突和树突免于凋亡和退行性病变，从而保持神经元及神经网络的完整性，这种巧妙的免疫逃避策略使病毒在神经细胞内成功繁殖［19］。Yang等［20］证实RABV引起天然免疫应答中树突状细胞的激活，该过程依赖于病毒G蛋白的表达，街毒无法激活树突状细胞产生天然免疫是因为G基因和与它相关的前导RNA的低水平表达。Li等［21］推测RABV街毒引起神经功能异常是由于神经突起变性和突触结构的破坏，研究发现脑内接种RABVN2C株，银染海马切片显示神经元突起发生严重的破坏和紊乱。Jackson等在表达黄色荧光蛋白小鼠的足垫内接种病毒来观察神经元突起的变化，在发病晚期，在大脑皮层第五层锥状神经元树突和轴突出现串珠样改变和肿胀。大量试验表明在RABV的感染模型中，神经递质包括乙酰胆碱［21－22］、五羟色胺［23］、γ氨基丁酸［24］的表达量存在异常。

3 RABV中和抗体的检测与评价

RABV G蛋白存在于病毒颗粒表面，是病毒结构蛋白中唯一能刺激机体产生中和抗体的蛋白，依靠其抗原性激发机体产生中和抗体是G蛋白的重要生物学功能之一。以下将对糖蛋白中和抗体的检测与评价进行阐述。

3.1中和抗体检测方法

目前测定RABV中和性抗体水平的方法大致可分为两种：抗原抗体结合检测及病毒中和试验检测。抗原抗体结合检测方法所使用的抗原，包括全病毒、纯化的多肽和模拟表位等类型，通过与RABV不同抗原位点结合能力进行分析、测定血清或脑脊液（CSF）中的RABV中和抗体含量，并可测定中和抗体的亲和力、活性及特异性。一般过程是将所用抗原结合到试管、平板、圆珠等固体表面，加入待测样品，抗原抗体反应，利用偶联荧光标记的二抗结合或底物反应等酶显色技术，检出样品中和性抗体的活性与含量。本方法的特点是既可检测与RABV表面抗原结合的中和性抗体，也可测定与内部蛋白抗原结合的抗体。病毒中和试验检测方法是基于神经细胞培养，将标准活病毒与待测样品中和抗体进行中和反应后，测定剩余病毒量，进而对待测血清或CSF中RABV中和抗体的含量进行评价的方法［25］。体外细胞培养物中的病毒中和机制，不仅依赖于RABV中和抗体与病毒抗原结合部位的相互作用，同时也受到神经细胞上的表面受体影响。研究表明RABV侵染CNS，一般是通过与CNS细胞上的乙酰胆碱受体、神经生长因子受体或神经细胞粘附分子结合，而对于非CNS细胞的侵染，所结合的其他受体至今仍不清楚［26］。

3.2不同检测方法的应用范围

实际应用中，选用适当的检测方法达到使用目的即可。抗原抗体结合检测方法可以用于判断中和性抗体的存在情况，免疫球蛋白的类型，也可用于机体产生中和抗体应答的确认。如以诊断RABV感染情况为目的，抗原抗体结合检测技术应为首选方法。该方法具有简单、易用、安全、快速等特点，能够简便快捷的达到检测需求。然而为了测定疫苗接种后的免疫效果，需要对血清中的中和抗体水平及活性进行测定。尽管抗原抗体结合检测技术有众多优点，但是通过中和试验测定出来的检测结果真实性最高，最接近中和抗体的真实抗病毒能力，所以最佳选择应采用病毒中和试验检测方法［27］。

3.3检测方法的评价标准

1992年WHO狂犬委员会第八次报告中，第一次提出将中和抗体效价为0.5IU／mL作为全球公认的保护效力临界值。报告关于RABV疫苗接种，指出常与RABV活毒接触的研究人员、医院检测人员、疫苗生产工作者等需要经常检测自身血清样品的中和性抗体水平，一旦抗体滴度低于0.5IU／mL，需加强疫苗接种。但是，规定的中和抗体0.5IU／mL是RABV暴露后，疫苗接种的标准，并不是动物机体有效保护能力标准［28］。Aubert［30］的研究提出利用RFFIT检测方法测定猫和狗的中和抗体水平，建议其保护性抗体水平临界值分别是0.1IU／mL和0.2IU／mL。但是已清除RABV地区引进外地猫和狗时，权威人士推荐RFFIT或者FAVN检测结果保护性抗体水平临界值为0.5IU／mL，该数值表明有足够能力抵抗RABV的侵染［29－30］。狂犬病免疫球蛋白产品的国际参考标准包括：WHO狂犬病免疫球蛋白第一国际标准，WHO狂犬病免疫球蛋白第二国际标准，以及OIE犬类狂犬免疫球蛋白标准。1955年，首次建立了RABV免疫球蛋白的最初国际标准，每安瓿86.6mg冻干疫苗产品，其效力值最低规定为86.6IU。随后，于1984年，规定效价值为59IU为WHO狂犬免疫球蛋白第一国际标准。1993年，将效价值30IU作为WHO狂犬免疫球蛋白的第二国际标准。确立效价值6.7IU作为OIE狂犬免疫球蛋白的国际标准。1997年，USFDA对WHO提供的两种标准效价值进行验证对比，2006年，堪萨斯州立大学狂犬病实验室再次进行了验证，结果表明，1997年WHO第一国际标准的效价值相对于第二标准减少了2.5%，而在2006年却减少了14%。虽然出现的差异没有统计学意义，但说明了使用不同参考标准对检测结果的影响。另外，结果计算方式对血清样品中和抗体效价进行评价，将产生截然不同的效价值。Welch等［31］使用的标准临界值分别为WHO推荐的0.5IU／mL和ACIP推荐的血清稀释度1∶5，比较3种不同ELISA检测方法与RFFIT检测方法的检测结果，利用RFFIT检测方法验证ELISA检测方法的稳定性与特异性。当使用ACIP的血清稀释度1∶5测定出结果，换用WHO的0.5IU／mL时，出现了不同的检测结果，证实了临界值的选定对于疫苗免疫效果的评价的重要性［31］。

实现RABV中和性抗体检测方法的标准化，能够对不同实验室研究结果进行比较，将对抗体特性和疫苗接种效果的评估具有深远意义。所以任何试验检测结果，都需要标注参考标准以及结果计算方式。

4 展 望

狂犬病作为历史悠久的人畜共患病，致死率高，病程痛苦，对其致病机制缺乏明确的认识，造成临床上尚无有效的治疗手段。研究RABVG基因在诱导机体体液免疫产生中和抗体和刺激T细胞作用产生细胞免疫的作用，RABVG基因与细胞受体的结合机制，RABVG基因在病毒致病性和嗜神经性中发挥的重要作用，对于揭示RABV感染机体、引起神经症状的致病机制奠定一定的理论基础。动物体内中和抗体水平的高低体现着机体抵抗病毒入侵的能力。RABV中和性抗体的研究，对于抑制RABV的传播与患病动物的治疗中，具有重要现实意义。

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（责任编辑 秦 彤）

中图分类号：Q71

文献标识码：A

文章编号：1671－7236（2016）12－3349－07

doi：10.16431／j.cnki.1671－7236.2016.12.039

收稿日期：2016－05－16

基金项目：宠物疫病快速诊断与疫苗研究与示范（3313022）；狂犬病病毒糖蛋白干预神经突触体递质释放循环功能的分子机制（31572505）

作者简介：汪孟航（1990－），男，黑龙江齐齐哈尔人，硕士生，研究方向：动物病毒疫苗与分子免疫学，E－mail：wmhtcs＠163.com

通信作者：＊温永俊（1979－），男，内蒙古呼和浩特人，副研究员，硕士生导师，研究方向：动物病毒疫苗与分子免疫学，E－mail：wenyongjun＠caas.cn

Advances in Biological Function of Rabies Virus Glycoprotein

WANG Meng－hang，ZHU Hong－wei，HE Min－hui，WEN Yong－jun＊，CHENG Shi－peng
（StateKeyLaboratoryforMolecularBiologyofSpecialEconomicAnimals，InstituteofWildEconomic AnimalsandPlants，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Changchun130112，China）

Abstract：Rabies is a lethal zoonotic infectious disease caused by rabies virus（RABV），which infected the central nervous system.The RABV glycoprotein exists on the surface of the virus particles，it is a major protective antigen which stimulate the body to produce the humoral immunity and cellular immunity；It is the identification of structure of the cell receptors；It plays an important role in the viral pathogenicity and tropism in the nerve，directly related to the virulence of virus.In this review，we summarized research progress of structure and function of RABV glycoprotein，and also reviewed the detection and evaluation of the neutralizing antibody.All these fundamental studies are important for the control and elimination of the RABV，to provide research basis for further revealing the biological function of RABV glycoprotein.

Key words：rabies；glycoprotein；neutralizing antibody